버퍼

출처: Smaa Koraym at Johns Hopkins University, MD, USA

1. 확장

   이 실험의 첫 번째 부분에서는 pH 7.0에서 완충된 인산나트륨 용액을 준비합니다. 인산 나트륨 (Monosodium phosphate)은 공액 염기 인 인산 나트륨 (disodium phosphate)을 가진 약산입니다. 조정되지 않은 인산나트륨 용액은 일반적으로 약 4 - 6의 pH를 갖습니다.

   완충액은 인산일나트륨의 경우 6.8-7.2인 pKa에 가장 효과적입니다. 따라서 NaOH를 사용하여 완충 평형의 전체 구성을 변경하지 않고 평형을 켤레 염기 쪽으로 밀어 넣습니다.

   • 실험을 시작하기 전에 200mL의 50mM 용액을 만드는 데 필요한 인산나트륨의 질량을 계산하십시오.

     표 1: 50mM NaH₂PO₄ 완충액, pH 7.0 준비

     NaH2PO4 의 몰 질량 = 119.98 g / mol
     용액 부피 (mL)	200
     몰 농도 (mM)	50
     NaH2PO4 (mol)의 몰
     필요한 질량 (mg)
     1M NaOH(mL)의 초기 부피
     1M NaOH(mL)의 최종 부피
     NaOH 사용량(mL)
     필요한 DI 물의 부피 (mL)

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     .
   • 시작하려면 실험복, 생활 방수 보안경, 장갑 등 필요한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 메모: 실험실의 이 섹션에서는 부식성 및 독성이 있는 NaOH를 사용합니다. NaOH를 붓고 운반할 때 주의하십시오.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-5">
   250mL 플라스틱 세척 병에 탈이온수를 채웁니다.
   • 100mL 비커 2개, 하나는 중성 수성 폐기물용이고 다른 하나는 기본 수성 폐기물용입니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-7">
   제공된 버퍼를 사용하여 pH 측정기를 교정합니다. 완료되면 프로브를 보관 용액에 보관하십시오.
   < 데이터 - 하위 메모 - 항목 = "1-8">
   종이의 무게를 측정하고 깨끗한 주걱을 사용하여 계산에 따라 필요한 인산나트륨의 양을 측정합니다. 실험실 노트에 인산일나트륨의 정확한 양을 기록하십시오. 메모: 인산 나트륨은 공기의 수분을 흡수하므로 정확한 측정을 위해 신속하게 작업하고 작업이 끝나면 용기를 단단히 닫으십시오.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-9">
   인산나트륨을 400mL 비커에 넣고 실험실용 물티슈로 주걱을 닦습니다. 흄 후드로 돌아가기 전에 계량지와 실험실 물티슈를 버리십시오.
   • 눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 175mL의 탈이온수를 측정합니다. 인산나트륨 비커에 물을 붓고 자석 교반 막대를 추가합니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-11">
   소금이 완전히 용해되고 용액이 균질하게 나타날 때까지 용액을 저어줍니다. 보통 2-3분 정도 걸립니다.
   < 데이터 - 하위 메모 - 항목 = "1-12">
   탈이온수 15mL를 계량하여 비커에 붓습니다. 용액이 다시 균질하게 나타날 때까지 용액을 계속 저어줍니다(약 1 – 2분). 교반 모터를 끕니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-13">
   pH 프로브를 탈이온수로 헹구고 clamp 교반 막대 위의 센서가 있는 용액에 넣습니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-14">
   10mL 눈금이 매겨진 실린더와 시계 유리를 디스펜싱 후드에 놓고 10mL의 1M NaOH를 측정합니다. 눈금이 매겨진 실린더의 정확한 부피를 확인합니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-15">
   NaOH를 시계 유리로 덮고 조심스럽게 흄 후드로 가져옵니다.
   • 인산나트륨 용액을 다시 저어줍니다. pH 판독값을 모니터링하는 동안 일회용 피펫을 사용하여 NaOH를 적하 방식으로 교반 용액에 천천히 첨가합니다. 완충액 pH가 7.0에 도달하면 피펫에 남아 있는 NaOH를 눈금이 매겨진 실린더로 되돌립니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-17">
   버퍼에 추가한 NaOH의 부피를 계산합니다. 10mL에서 해당 부피를 빼서 총 용액 부피가 200mL에 도달하기 위해 버퍼에 추가해야 하는 탈이온수의 양을 계산합니다.
   • 다른 10mL 눈금이 매겨진 실린더로 탈이온수를 측정하고 교반 용액에 첨가하여 완충액 만들기를 마칩니다.
   • pH 센서를 탈이온수로 헹구고 보관 용액을 채운 캡으로 덮은 다음 프로브의 플러그를 뽑거나 끕니다.
   • 250mL 폴리에틸렌 병에 '50mM 인산일나트륨 버퍼, pH 7.0'으로 라벨을 붙입니다. 용액에서 마그네틱 교반 막대를 회수합니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-21">
   깔때기를 사용하여 완충 용액을 라벨이 붙은 병에 붓고 단단히 뚜껑을 닫습니다.
2. >자유 및 결합 중성 빨간색의 흡수 분광법확장

   버퍼는 특정 pH 값에서 화합물을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 섹션에서는 다양한 버퍼에서 빨간색 중립 표시기의 흡광도 스펙트럼을 기록합니다. 중성 적색의 양성자화된 형태는 빨간색이고 탈양성자화된 형태는 황색-주황색으로 각각 녹색과 청자색-보라색 빛을 흡수합니다. 따라서 산성 형태와 염기성 형태는 뚜렷한 흡수 파장을 갖습니다. 단백질 결합은 중성 적색의 특성을 변경하여 흡광도와 pKa를 모두 변화시킵니다.

   여러 pH 값에서 유리 중성 적색의 흡광도 스펙트럼을 측정한 후 용액에 리보플라빈 결합 단백질(RP)을 추가하고 흡광도를 다시 측정합니다. 흡광도 강도는 농도와 관련이 있으므로 실험 후 스펙트럼을 사용하여 자유 및 결합 중성 적색의 pKa를 결정합니다.

   < 데이터 하위 노트 항목 = "2-3">
   랩 노트북에 다음 표를 그립니다. 큐벳에 1에서 10까지 번호를 매기고 사용할 9개의 버퍼 pH 값을 나열합니다. 10번째 큐벳은 탈이온수 블랭크가 될 것입니다. 메모: 항상 질감이 있는 면을 큐벳으로 잡고 큐벳을 분광 광도계에 넣기 직전에 투명한 면을 닦습니다. 투명한 면을 분광 광도계의 광선에 맞추는 것을 잊지 마십시오.
   표 2: Free and Bound Neutral Red의 흡광도
   큐벳 #	pH 완충기	>λmax에서 절대(Free NRH+)	>λmax에서 절대(Bound NRH)
   1	5.0
   2	5.5
   3	6.0
   4	6.5
   5	7.0
   6	7.5
   7	8.0
   8	8.5
   9	11
   10	blank
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   . < 데이터 하위 노트 항목 = "2-4">
   10개의 1.5mL 큐벳과 캡을 구하고 랩 노트의 표와 일치하도록 캡 1에서 10까지 레이블을 지정합니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "2-5">
   25mL 비커에 'DIH2O'라는 라벨을 붙이고 탈이온수로 채웁니다.
   • 중성 수성 폐기물을 배수구로 흘려보내고 비커에 '수성 완충 폐기물'이라는 레이블을 다시 붙입니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "2-7">
   사용한 마이크로피펫 팁에 대해 400mL 비커에 레이블을 지정합니다.
   • 1mL 마이크로피펫에 팁을 부착하고 이를 사용하여 1000μL의 탈이온수를 큐벳 10에 분주합니다. 이것은 용제 블랭크입니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "2-9">
   pH 7.0 인산일나트륨 완충액 925μL를 큐벳 5에 넣습니다.
   • 나머지 빈 큐벳을 버퍼 테이블로 가져옵니다. 실험실 노트의 표에 따라 표지된 마이크로피펫을 사용하여 각 버퍼의 925μL를 적절한 큐벳에 분주합니다. 다른 버퍼에 동일한 피펫 팁을 사용하지 않도록 주의하십시오.
   • 완료되면 버퍼를 워크벤치로 다시 가져옵니다. 여기에서 200μL 마이크로피펫을 설정하여 75μL를 분주하고 마이크로피펫에 팁을 부착합니다.
   • 9개의 버퍼 큐벳 각각에 75μL의 중적색을 분배합니다. 각 큐벳을 여러 번 뒤집어 용액을 완전히 혼합합니다. 메모: 피펫 팁이 버퍼에 닿으면 교체하십시오.
   • 모든 버퍼와 중성 빨간색을 혼합하면 사진을 찍거나 솔루션의 색상을 기록하십시오.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "2-14">
   휴대용 분광 광도계를 켜고 광원이 예열되도록 합니다. 준비가 되면 자유 중적색에 대한 파장 대 흡광도를 측정하는 새로운 실험을 만듭니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "2-15">
   탈이온수 큐벳을 삽입하고 탈이온수의 스펙트럼을 얻습니다. 용매 배경 또는 공백으로 설정하십시오.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "2-16">
   그런 다음 블랭크를 제거하고 양성자화된 중성 적색의 농도가 가장 높은 가장 낮은 pH 버퍼에 중성 적색 큐벳을 삽입합니다.
   • 하나의 강력한 피크를 보여줘야 하는 스펙트럼을 획득합니다. 이 피크의 가장 높은 지점 또는 최대 지점에 해당하는 파장을 식별합니다. 이 파장을 실험실 노트북에 양성자화된 자유 중적색에 대한 lambda max로 기록하십시오.
   • 데이터를 저장하고 큐벳을 제거합니다. 노트북에 흡광도를 기록한 다음 동일한 절차를 사용하여 큐벳 2 - 9에 대한 스펙트럼을 수집합니다.
   < 데이터 - 하위 메모 - 항목 = "2-19">
   실험실 노트에 이소베스트 포인트의 파장을 기록하십시오. 그것은 모든 스펙트럼이 단일 파장에서 교차하는 곳입니다. 이 지점에서 스펙트럼이 교차하지 않으면 큐벳을 비우고 세척한 후 새 검체를 준비한 후 다시 시도하십시오.
   < 데이터 - 하위 메모 - 항목 = "2-20">
   9개의 큐벳 모두에 대한 스펙트럼 수집이 완료되면 데이터를 저장하고 내보냅니다.
   • 바운드 중성 적색에 대한 파장 대 흡광도를 측정하는 새로운 실험을 만듭니다.
   • 200μL 마이크로피펫에 새 팁을 끼우고 블랭크를 포함한 각 큐벳에 75μL의 리보플라빈 결합 단백질 용액을 추가합니다. 팁을 꺼내고, 큐벳 캡을 고정하고, 큐벳을 여러 번 뒤집어 용액을 혼합합니다.
   • 큐벳 10을 분광 광도계에 삽입하고 용매 블랭크로 설정합니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "2-24">
   가장 낮은 pH 샘플의 스펙트럼을 획득하고 가장 강렬한 피크의 최대값에 해당하는 파장을 식별합니다. 이를 실험실 노트에 protonated-bound neutral red의 lambda max로 기록하십시오.
   • 무료 중성 적색 샘플에 대해 했던 것과 동일한 방식으로 큐벳 2 - 9에 대한 스펙트럼을 획득합니다. 표에서 protonated-bound neutral red에 대한 lambda max의 강도를 isosbestic point의 파장과 함께 기록하십시오.
   < 데이터 - 하위 메모 - 항목 = "2-26">
   완료되면 데이터를 저장하고 나중에 분석하기 위해 내보내고 분광 광도계를 종료합니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "2-27">
   모든 장비를 치우고 사용한 피펫 팁을 승인된 폐기물 용기 또는 쓰레기통에 폐기하십시오.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "2-28">
   큐벳을 수성 버퍼 폐기물 비커에 비우고 큐벳을 탈이온수로 비커에 헹굽니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "2-29">
   여분의 NaOH를 기본 폐기물로 비우고 눈금이 매겨진 실린더를 물로 헹굽니다.
   • 다른 수성 폐기물과 함께 풍부한 수돗물로 기본 수성 폐기물을 배수구로 씻어냅니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "2-31">
   실험실 표준 절차에 따라 유리 제품, 큐벳 캡 및 교반 막대를 세척하십시오. 젖은 종이 타월로 작업 표면을 청소하고 사용한 종이 타월과 실험실 물티슈는 실험실 쓰레기통에 버리십시오.
3. 확장

   이제 흡광도 데이터를 분석하여 중성 적색의 pKa를 알아보겠습니다.

   표 3: 중성 적색 pKa 측정

   	무료 NRH+	바운드 NRH+
   λ최대 (nm)
   ΔA (nm)
   중간점(nm)
   피카

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   .
   • y축에서 lambda max의 흡광도 강도와 x축의 pH를 사용하여 두 개의 강도 데이터 세트를 부드러운 선으로 결합한 점으로 플로팅합니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "3-3">
   각 데이터 계열에 대한 시작 및 끝 흡광도 강도의 차이를 계산합니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "3-4">
   각 계열의 시작 흡광도와 끝 흡광도 사이의 중간 또는 흡광도 중간점을 결정합니다.
   • 각 라인에서 중간점이 발생하는 위치를 찾고 해당 지점에서 pH 값을 식별합니다. 이러한 pH 값은 자유 및 결합 중성 적색의 pKa입니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "3-6">
   여기서 우리는 자유 중성 적색과 결합 중성 적색 사이에서 약 1의 pKa 증가를 볼 수 있으며, 이는 결합 양성자 화 중성 적색이 자유 양성자 화 중성 적색보다 한 자릿수 더 약한 산임을 나타냅니다.