RNA-seq

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RNA 염기서열분석 또는 RNA-seq는 샘플에서 RNA 염기서열분석을 식별하고 정량화하는 고처리량 염기서열분석 기술입니다.

전체 RNA 또는 mRNA, tRNA, rRNA 및 miRNA와 같은 특정 RNA 집단을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 전사체 분석, 차등 유전자 발현 분석 및 RNA 편집에서 다양한 응용 분야를 가지고 있습니다.

특정 집단 분석의 경우, 관심 있는 RNA 유형을 다른 RNA와 분리해야 합니다. mRNA는 mRNA 전사체에 존재하는 poly A 꼬리를 보완하는 oligo dT 프로브를 사용하여 분리할 수 있습니다. 일반적으로 약 15-30개의 뉴클레오티드 길이인 MicroRNA는 크기 기반 추출 방법으로 분리됩니다.

대안적으로, 리보솜 RNA와 같은 오염 RNA는 오염 물질에 상보적이고 자성 비드에 공유 결합되어 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제거할 수 있습니다. 혼성화된 리보솜 RNA는 자석을 사용하여 샘플에서 분리되어 관심 RNA를 남깁니다.

정제된 RNA는 효소 역전사 효소에 의해 주형으로 사용되어 cDNA를 생성하고, 이는 PCR을 사용하여 추가로 증폭되어 염기서열분석을 위한 라이브러리를 생성합니다.

염기서열분석은 사용 가능한 여러 기술 중 하나를 통해 수행할 수 있습니다. 가장 흔한 것 중 하나에서, cDNA 단편은 PCR 증폭을 위한 프라이머 결합 부위 역할을 하는 어댑터로 알려진 짧은 올리고뉴클레오티드 서열과 결찰됩니다. 어댑터는 또한 각 cDNA 가닥을 태그하고 식별하는 데 사용되는 바코드 염기서열이라고 하는 고유한 염기서열을 가질 수 있습니다.

그런 다음 PCR을 사용하여 라이브러리를 증폭합니다. 그 후, 낮은 농도로 희석되고 열에 의해 단일 가닥으로 변성된 후, 어댑터에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 구성된 시퀀싱 칩에서 고정화됩니다.

일단 부착되면 단일 가닥 DNA는 브리지 증폭과 같은 프로세스를 사용하여 복제되어 동일한 염기서열을 가진 DNA 클러스터를 형성합니다. 이렇게 하면 칩의 한 영역에서 나온 가닥이 단일 소스에서 온 것이고 시퀀싱 중에 균일한 신호를 방출할 수 있습니다.

염기서열분석은 가닥 특이적 또는 비가닥 특이적일 수 있습니다. 가닥 특이적 프로토콜의 경우, 상보적인 가닥은 씻겨 나가고 다른 하나는 염기서열분석에 사용됩니다.

그런 다음 형광 표지된 뉴클레오티드를 칩의 가닥에 추가하여 새로운 상보적 가닥을 만듭니다. 각 첨가물에서 특징적인 형광이 방출되며, 이는 검출기로 판독할 수 있습니다.

이러한 방법을 사용하여 수백만 개의 고유한 cDNA 단편 클러스터를 동시에 염기서열분석할 수 있습니다. 그런 다음 결과 데이터를 참조 게놈에 정렬하고 조합하여 분석을 위한 RNA 염기서열 맵을 생성할 수 있습니다.

Overview

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA 시퀀싱(RNA-Seq)은 세포의 전사체를 연구하는 데 사용되는 높은 처리량의 시퀀싱 기술입니다. 전사체학은 게놈의 기능적 요소를 해석하고 유기체의 분자 구성 요소를 식별하는 데 도움이 됩니다. 또한 유기체의 발달과 질병의 발생을 이해하는 데에도 도움이 됩니다.

RNA-seq이 발견되기 전에는 전사체 분석을 위해 마이크로어레이 기반 방법과 생어 시퀀싱이 사용되었습니다. 그러나 마이크로어레이 기반 기술은 제한된 적용 범위와 기존 게놈 지식에 대한 의존성 등의 단점이 있는 반면, 생어 시퀀싱에는 낮은 처리량, 높은 비용, 부정확한 결과 등의 한계가 있습니다. 반면, RNA-seq은 상대적으로 더 높은 적용 범위와 더 높은 처리량을 제공하는 차세대 시퀀싱(NGS) 기술입니다. 또한 새로운 전사물을 발견하고, 대립유전자 특이적 정보를 이해하고, 대체적으로 접합된 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있는 추가 자료를 생성합니다.

RNA-seq 과정은 여러 단계로 나눌 수 있습니다. 첫 번째 단계는 표본에서 관심 있는 RNA를 추출 및 분리한 다음 이 RNA를 상보적인 DNA로 전환하는 것입니다. 이를 통해 분자의 안정성, 손쉬운 취급 및 NGS 작업 흐름에 투입할 수 있는 능력이 보장됩니다. 다음으로, 어댑터라고 알려진 서열이 DNA 단편에 부착되어 시퀀스 분석이 가능해집니다. RNA-seq에 가장 널리 사용되는 NGS 플랫폼에는 SOLiD, Ion Torrent 및 HiSeq가 있습니다. 라이브러리가 시퀀싱되는 깊이는 실험의 최종 목표에 따라 다릅니다. 예를 들어 시퀀싱에는 단일 읽기 또는 페어드 엔드 시퀀싱 방법이 포함될 수 있습니다. 한쪽 끝에서만 DNA를 서열 분석하는 단일 판독 시퀀싱은 더 저렴하고 빠른 기술인 반면, 양쪽 끝에서 서열 분석을 포함하는 쌍방향 방법은 더 비싸고 시간이 많이 걸립니다. 또한 어떤 DNA 가닥이 전사되었는지에 대한 추가 정보도 가닥별 프로토콜을 통해 유지될 수 있습니다.

그런 다음 시퀀싱 자료는 참조 게놈에 정렬되고 해당 RNA 서열 지도를 생성하는 데 사용됩니다. 분석의 성격에 따라 다양한 생물정보학 도구를 사용하여 자료를 처리할 수 있습니다. 예를 들어, BitSeq 및 RSEM은 발현 수준을 정량화하는 데 도움이 되는 반면 MISO는 대체적으로 접합된 유전자를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.