15.14: RNA-염기서열분석

RNA 염기서열분석 또는 RNA-seq는 샘플에서 RNA 염기서열분석을 식별하고 정량화하는 고처리량 염기서열분석 기술입니다.

전체 RNA 또는 mRNA, tRNA, rRNA 및 miRNA와 같은 특정 RNA 집단을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 전사체 분석, 차등 유전자 발현 분석 및 RNA 편집에서 다양한 응용 분야를 가지고 있습니다.

특정 집단 분석의 경우, 관심 있는 RNA 유형을 다른 RNA와 분리해야 합니다. mRNA는 mRNA 전사체에 존재하는 poly A 꼬리를 보완하는 oligo dT 프로브를 사용하여 분리할 수 있습니다. 일반적으로 약 15-30개의 뉴클레오티드 길이인 MicroRNA는 크기 기반 추출 방법으로 분리됩니다.

대안적으로, 리보솜 RNA와 같은 오염 RNA는 오염 물질에 상보적이고 자성 비드에 공유 결합되어 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제거할 수 있습니다. 혼성화된 리보솜 RNA는 자석을 사용하여 샘플에서 분리되어 관심 RNA를 남깁니다.

정제된 RNA는 효소 역전사 효소에 의해 주형으로 사용되어 cDNA를 생성하고, 이는 PCR을 사용하여 추가로 증폭되어 염기서열분석을 위한 라이브러리를 생성합니다.

염기서열분석은 사용 가능한 여러 기술 중 하나를 통해 수행할 수 있습니다. 가장 흔한 것 중 하나에서, cDNA 단편은 PCR 증폭을 위한 프라이머 결합 부위 역할을 하는 어댑터로 알려진 짧은 올리고뉴클레오티드 서열과 결찰됩니다. 어댑터는 또한 각 cDNA 가닥을 태그하고 식별하는 데 사용되는 바코드 염기서열이라고 하는 고유한 염기서열을 가질 수 있습니다.

그런 다음 PCR을 사용하여 라이브러리를 증폭합니다. 그 후, 낮은 농도로 희석되고 열에 의해 단일 가닥으로 변성된 후, 어댑터에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 구성된 시퀀싱 칩에서 고정화됩니다.

일단 부착되면 단일 가닥 DNA는 브리지 증폭과 같은 프로세스를 사용하여 복제되어 동일한 염기서열을 가진 DNA 클러스터를 형성합니다. 이렇게 하면 칩의 한 영역에서 나온 가닥이 단일 소스에서 온 것이고 시퀀싱 중에 균일한 신호를 방출할 수 있습니다.

염기서열분석은 가닥 특이적 또는 비가닥 특이적일 수 있습니다. 가닥 특이적 프로토콜의 경우, 상보적인 가닥은 씻겨 나가고 다른 하나는 염기서열분석에 사용됩니다.

그런 다음 형광 표지된 뉴클레오티드를 칩의 가닥에 추가하여 새로운 상보적 가닥을 만듭니다. 각 첨가물에서 특징적인 형광이 방출되며, 이는 검출기로 판독할 수 있습니다.

이러한 방법을 사용하여 수백만 개의 고유한 cDNA 단편 클러스터를 동시에 염기서열분석할 수 있습니다. 그런 다음 결과 데이터를 참조 게놈에 정렬하고 조합하여 분석을 위한 RNA 염기서열 맵을 생성할 수 있습니다.