gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

요약

이 동영상은 마우스 splenocytes의 단일 셀 suspensions를 준비하는 gentleMACS의 Dissociator를 사용하여 자동 조직 분리에 대한 간단한 시간 절약 기법을 설명합니다.

초록

단일 셀 suspensions는 세포 분리, 세포 분석 및 세포 배양 실험에 꼭 필요합니다. 지루하고 고통스러운 종종 수동 dissociations을 피하기 위해 gentleMACS의 Dissociator 하나는 제어하고 재현성 조건 하에서 매우 효율적으로 조직을 떼어 놓다 수 있습니다. gentleMACS의 Dissociator는 최적의 사용자 안전을 절약해주는 및 표준화를 결합, 마우스 비장을 떼어 놓다 수 있습니다. 이 동영상은 gentleMACS Dissociator, 기계적으로 생균 suspensions을 생산하기 위해 특수 튜브를 사용하여 조직을 중단 수있는 자동화된 벤치 - 탑 장치를 사용 마우스 spleens을 떼어 놓다하는 방법에 대해 설명합니다. 분리 후, spleens는 여과 centrifuged, 추가적인 애플 리케이션을위한 resuspended 있습니다.

프로토콜

장비 소개

1. 조직은 가능한 단일 셀 suspensions에 보라색 C 튜브를 사용하여 부드럽게 dissociated 있습니다.
2. PBS / BSA EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼는 세포를 떼어 놓다하는 데 사용됩니다. 버퍼는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 솔루션을 Rinsing autoMACS 20 부분 BSA 주식 솔루션 1 부분을 추가하여 준비가되어 있습니다.
3. 맥 사전 분리 필터는 성공적인 맥 분리 및 후속 분석을 추진, dissociated 조직 샘플은 모든 세포 대단히 짧은 시간 무료 수 있도록하는 데 사용됩니다.

비장 세포를 Dissociating

1. 전체 spleens은 gentleMACS의 Dissociator를 사용 splenocytes의 단일 셀 suspensions에 disscociated 있습니다.
2. 절차를 시작하려면 spleens의 질량에 따라 버퍼의 볼륨 C 튜브를로드합니다. 젊은 성인 여성의 BALB / C 마우스의 건강한 비장은 80-120에 대한 MG 무게. 이 질량의 모든 1-2 spleens 버퍼 3 ML이 필요합니다. 감염과 오래된 동물이나 동물에서 Spleens는 종종 큰되며 버퍼에 무게해야합니다. 버퍼 볼륨 따라 크기를 조정해야합니다. 10 ML 총 버퍼 량을 초과하지 마십시오.
3. 버퍼 3 ML를 포함하는 C 튜브로 해부하는 비장을 추가합니다.
4. C 튜브 뚜껑이 꽉 있는지 확인하고 아래 뚜껑으로 dissociator에 C 튜브를 연결합니다.
5. dissociator 최대 전력. 1-2 spleens 들어, 프로그램 m_spleen_01을 선택합니다. 이 프로그램은 완료 56초를 취할 것입니다. spleens의 수가 큰 경우, 프로그램 m_spleen_04을 사용하여,이 프로그램은 비장 조직의 720 밀리그램을 위해 사용할 수 있습니다.
6. 프로그램의 완성 후에 기본 비장 조직 splenocyte 현탁액에 dissociated 있습니다.
7. 약 30 초에 대한 상온에서 300xg에서 전체 세포 현탁액을 스핀. 이것은 로터와 스테 이터가 C 튜브의 하단에 수집된 모든 세포의 해제되어 있는지 확인합니다.
8. 1000 microliter의 pipetter를 사용하여 C 튜브 캡의 심장 - 봉인 개방을 통해 샘플을 제거합니다.

여과 단계

1. 여과 단계를 시작하려면 사전 분리 필터 30 μm의 기공 크기가 셀 스트레이너에 dissociated 조직을 적용합니다. 스트레이너는 2 개 이상 spleens 1-2 spleens 또는 50 ML 튜브에 대한 15 ML 튜브에 맞게해야합니다.
2. 세포 현탁액이 통과하자. 그렇다면 버퍼의 5 ML을 적용하여 필터를 세척.
3. 자, 비장 세포 펠렛의 모든 splenocytes를 수집하는 10 분 동안 상온에서 300xg에서 세포 현탁액으로 튜브를 원심 분리기.
4. 이제 우리는 dissociated splenocytes의 펠렛을 가지고, 우리는 뜨는을 기음과 버퍼의 적절한 금액 세포 펠렛을 resuspend한다.

gentleMACS의 Dissociator를 사용하여 비장의 분리는 MACSQuant 분석기를 사용 유동세포계측법으로 증명 가능한 splenocytes의 높은 비율을 얻을 것입니다. 죽은 세포는 propidium 요오드화물의로 물들어있다. 제공된 예제에서는 앞으로 사이드 분산형 점 줄거리는 준비된 splenocytes를 보여줍니다.

토론

지루하고 고통스러운 종종 수동 dissociations를 방지하려면 gentleMACS의 Dissociator 하나는 제어하고 재현성 조건 하에서 매우 효율적으로 조직을 떼어 놓다 수 있습니다. 조직 분리 절차는 높은 생존 속도로 세포 수율 세포 suspensions에 부드러운 있습니다. C 튜브와 함께 gentleMACS의 Dissociator 다양한 조직에서 단일 셀 suspensions의 준비를 위해 설계되었습니다. 악기는 마우스 비장, 간, 폐, 또는 신경 조직을 떼어 놓다로 사전 설정된 프로그램의 숫자를 갖추고 있습니다. 프로그램 및 프로토콜의 범위는 지속적으로 추가 조직을 포함하도록 확장됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
gentleMACS™ 시작 키트	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C 튜브	Miltenyi Biotec	130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL 튜브	Miltenyi Biotec	130-091-596	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ 세척액	Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA 스톡 용액	Miltenyi Biotec	130-091-376	<장비 소개 조직은 violet C Tube를 사용하여 생존 가능한 단일 세포 현탁액으로 완만하게 해리됩니다. 세포 해리를 위해 PBS/BSA EDTA 완충액이 사용됩니다. 이 완충액은 BSA 스톡 솔루션 1부와 EDTA가 포함된 autoMACS Rinsing Solution 20부를 혼합하여 준비합니다. 해리된 조직 샘플에서 모든 세포 응집물을 제거하여 성공적인 MACS 분리와 후속 분석을 촉진하기 위해 MACS Pre-Separation Filter를 사용합니다. 비장 세포 해리 전체 비장은 gentleMACS Dissociator를 사용하여 비장세포의 단일 세포 현탁액으로 해리됩니다. 절차를 시작하려면 비장의 질량에 따라 적절한 양의 완충액을 C Tube에 넣으십시오. 건강한 성체 암컷 BALB/c 마우스의 비장 무게는 약 80-120 mg입니다. 이 정도 질량의 비장 1-2개당 3 mL의 완충액이 필요합니다. 노령 동물이나 감염된 동물의 비장은 흔히 더 크므로 완충액 내에서 무게를 측정해야 하며, 이에 따라 완충액의 양을 조정해야 합니다. 전체 완충액의 양이 10 mL를 초과하지 않도록 하십시오. 절제된 비장을 완충액 3 mL가 들어 있는 C Tube에 넣으십시오. C Tube 캡이 단단히 닫혔는지 확인하고 캡이 아래로 향하도록 C Tube를 해리기에 연결하십시오. 해리기의 전원을 켭니다. 비장이 1-2개인 경우 m_spleen_01 프로그램을 선택하십시오. 프로그램 완료까지 56초가 소요됩니다. 비장의 수가 더 많은 경우에는 m_spleen_04 프로그램을 사용하십시오. 이 프로그램은 최대 720 mg의 비장 조직까지 사용할 수 있습니다. 프로그램이 완료되면 천연 비장 조직이 비장세포 현탁액으로 해리됩니다. 전체 세포 현탁액을 실온에서 300xg로 약 30초 동안 원심 분리하십시오. 이렇게 하면 로터와 스테이터에서 모든 세포가 제거되어 C Tube 바닥에 수집됩니다. 1000 $\mu\text{L}$ 피펫을 사용하여 C Tube 캡의 격막 밀봉 개구부를 통해 샘플을 제거하십시오. 여과 단계 여과 단계를 시작하려면 해리된 조직을 Pre-Separation Filter 또는 공극 크기가 30 $\mu\text{m}$인 세포 스트레이너에 적용하십시오. 스트레이너는 비장 1-2개의 경우 15 mL 튜브에, 2개 이상의 경우 50 mL 튜브에 맞아야 합니다. 세포 현탁액이 통과하도록 둡니다. 그런 다음 완충액 5 mL를 가하여 필터를 세척하십시오. 이제 세포 현탁액이 든 튜브를 실온에서 300xg로 10분 동안 원심 분리하여 모든 비장세포를 비장세포 펠렛으로 수집하십시오. 해리된 비장세포 펠렛이 준비되면 상층액을 흡입 제거하고 세포 펠렛을 적절한 양의 완충액에 재현탁해야 합니다. gentleMACS Dissociator를 이용한 비장 해리는 높은 비율의 생존 비장세포를 얻을 수 있으며, 이는 MACSQuant Analyzer를 이용한 유세포 분석으로 증명됩니다. 사멸 세포는 propidium iodide로 염색됩니다. 제공된 예시에서 전방 산란 및 측방 산란 도트 플롯(forward side scatter dot plot)은 준비된 비장세포를 보여줍니다."http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
분리 전 필터	Miltenyi Biotec	130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec	130-092-197
프로피듐 요오드화물 용액	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx