사진 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP) Amyloidogenic 펩티드에 적용

요약

사진 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP)의 것은​​ metastable 단백질 혼합물의 올리고머 크기 분포의 특성을 허용합니다. 우리는 세 대표 amyloidogenic 펩티드 40 PICUP의 응용 프로그램을 보여줍니다 - 그리고 아밀로이드 β 단백질 및 칼시토닌의 42 잔여물 형태 및 제어 펩타이드 성장 호르몬 방출 인자.

초록

독성 oligomers로 amyloidogenic 단백질의 조립은 알츠하이머, 파킨슨병과 헌팅턴의 질병, 유전 루게릭병, 그리고 2 형 당뇨병을 포함한 단백질 misfolding 질환의 pathogenesis에 있게한 이벤트입니다. 이러한 단백질 어셈블리의 metastable 특성 때문에, 그것은 전기, 크로마 토그래피, 형광, 또는 동적 광 산란과 같은 고전적인 방법을 사용하여 양적 자신의 올리고머의 크기 분포를 평가하기 어렵습니다. amyloidogenic 단백질 Oligomers은 oligomers가 단량체로 교제를 끊다 동시에 큰 어셈블리에 연결할하는 metastable 혼합물로 존재합니다. PICUP 교차하기 전에 존재 올리고머 크기 배포판 공유 결합 가교와 같은 나트륨 dodecyl 황산염의 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS - PAGE) 또는 크기 배제 크로마 토그래피 (SEC)와 같은 분류 방법과 결합하면 PICUP이 제공하는 스냅샷의 올리고머의 인구 안정화 - 연결. 따라서, PICUP는 metastable 단백질 인구의 시각화 및 정량 분석​​을 가능하게하고 시퀀스 수정 및 oligomerization 사이의 조립 및 해독 관계를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다

프로토콜

1. 펩타이드 준비

1. 라벨, 실리콘 코팅, 낮은 흡착제 microfuge 튜브에 microbalance 및 전송을 사용하여 동결 건조된 펩타이드의 ~ 100-200 μg를 달다. 여기, 우리는 Aβ40의 인간 시퀀스, Aβ42, 칼시토닌, 그리고 GRF를 사용합니다.
2. 여기, 우리는 단일 펩티드, 집계없는 준비를 얻기 위해 1,1,1,3,3,3 - hexafluoro - 2 - 프로파놀 (HFIP)로 사전 처리를 사용합니다. 사전 구성된 집계가 실험 ⁵ 중에서 가난한 재현성의 결과 amyloidogenic 단백질의 신속한 집계를 유발하기 때문에이 단계가 필요합니다. 이러한 여과 및 SEC와 같은 다른 방법도 PICUP ⁶ 총체적없는 준비를 얻는 데 사용할 수 있습니다.
3. HFIP와 펩티드를 치료하기 위해 적절한 보호 (HFIP는 휘발성과 독성)을 입고 연기 후드 안에 얼음 HFIP 컨테이너를 미리 진정해. 250 ML 병의 냉각하면 일반적으로 10-15 분 필요합니다. 0.5 mm의 공칭 펩타이드 농도를 구하는 펩티드 lyophilizates를 포함하는 미리 차게 튜브에 HFIP를 추가합니다.
4. 상온에서 5 분 물 목욕 sonicator의 펩타이드 솔루션을 Sonicate.
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토론

PICUP는 안정적인 단백질 단지 ² 공부 원래 개발되었습니다. 방법은 Aβ ^10, 프리온 질병 - 관련 PrP ^{SC 11,} 및 α - synuclein ^12를 포함한 metastable 아밀로이드 단백질 어셈블리의 양적 연구 나중에 적용되었다. PICUP 실험을 디자인할 때 고려되어야하는 가장 중요한 요소는 시약의 stoichiometry, 조사 시간 및 샘플 준비 절차입니다. 후자 문제가 크게 실험 데이터의 해석에 영향을 미치는 반면 전직 두 가지 문제는 경험적 최적화가 필요할 수 있습니다. 특히 amyloidogenic 단백질 들어, metastable oligomers의 크기 배포판의 결정은 집계가없는 시작 준비를 사용합니다. 배경, 메커니즘, 계측, 프로토콜, 최적화, 범위, 수정, 응용 프로그램 및 PICUP의 제한은 이전 출판물 ^1,2,13로 덮여 있었다. PICUP는 다음과 같은 분류와 정화가, 구조 연구, 세포 독성의 assays, oligomeriz.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dolan-Jenner 200-W 백열전구	기타	Dolan-Jenner Industries	모델 170-D	램프에서 발생하는 열은–짧은 배양 시간 동안에는 시료에 영향을 미치지 않습니다.
35mm SLR 카메라 바디	도구	Pentax	SP500 모델	본 실험 설정에서는 카메라 본체에 벨로우즈(bellows)를 부착하여, 광원으로부터 10cm 떨어진 곳에 배치된 시료에 조사(irradiation)를 수행할 수 있는 편리한 챔버를 제공합니다.
투명하고 벽이 얇은 PCR 튜브	기타	Eppendorf	Fisher에서 공급하는 951010006 L22-003-24
유리 바이알 (1.8 mL)	기타	킴블 체이스	Fisher 03-340-60에서 공급하는 60940A 2
GRF	시약	Bachem	H-3695
헥사플루오로이소프로판올	시약	TCI America	H0424	흄 후드 내에서 사용하십시오.
Aβ40 및 Aβ42	시약	UCLA 생체고분자 연구실
칼시토닌	시약	American Peptide	22-1-10
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate	시약	Sigma-Aldrich	224758-1G	용액이 투명해질 때까지 볼텍싱하십시오. 주변 빛으로부터 시약을 보호하기 위해 RuBpy 튜브를 알루미늄 호일로 감싸십시오. RuBpy는 매번 새로 조제하며 48시간 이내에 사용해야 합니다.
과황산암모늄	시약	Sigma-Aldrich	A-7460	용액이 투명해질 때까지 볼텍싱하십시오. APS는 매번 새로 조제하며, 48시간 이내에 사용해야 합니다.
β-메르캅토–에탄올	시약	Sigma-Aldrich	M7154-25 ML	SDS-PAGE 분석을 수행할 때 사용할 수 있습니다.
Novex Tricine SDS 시료 완충액 (2x)	시약	Invitrogen	LC1676
XCell SureLock 미니셀	도구	Invitrogen	EI0001
Novex Tricine 겔 (10-20%)	기타	Invitrogen	EC6625B0X
Novex Tricine SDS 전기영동 버퍼 (10x)		Invitrogen	LC1675
실버 익스프레스 염색 키트		Invitrogen	LC6100