전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

요약

전체 plasmids의 사이트 이동 돌연변이 유발은 원래 플라스미드의 약간 다른 유사 콘텐츠를 작성하는 간단한 방법입니다. 여기서 우리는 플라스미드를 사용 표준 시약에 기본 재료를 소개하는 쉽고 비용 효과적인 방법을 보여줍니다.

초록

전체 plasmids의 사이트 이동 돌연변이 유발은 원래 플라스미드의 약간 다른 유사 콘텐츠를 작성하는 간단한 방법입니다. 이 방법으로 복제된 대상 유전자 직접 플라스미드로 몇 기지의 대체, 삭제 또는 삽입하여 변경할 수 있습니다. 그것은 단순히이 아닌 PCR 기반 thermocycling 반응에서 전체 플라스미드를 확장하여 사용할 수 있습니다. 반응 동안 원하는 돌연변이를 운반 mutagenic primers는, 새로 합성 플라스미드에 통합되어 있습니다. 이 비디오 튜토리얼에서 우리는 플라스미드에 기본 재료를 소개하는 쉽고 비용 효과적인 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 표준 시약 작동 종종 매우 비싼 상용 키트에서 독립적입니다. 이 프로토콜을 적용하는 것은 그것이 상업 키트의 일부를 사용하는 비용은 무엇 여덟째에 대한 반응의 총 비용을 줄일 수 있습니다. 이 비디오에서 우리는 또한 과정에서 중요한 단계에 대해 언급하고 mutagenic primers를 디자인하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다.

프로토콜

방법의 원리 :

이 사이트는 전체 plasmids의 돌연변이 유발이 동영상에 직접 플라스미드로 몇 기지의 대체, 삭제 또는 삽입하여 복제된 대상 유전자를 변경할 수있는 돌연변이 유발 방법이 설명 감독. 그것은 비 PCR 기반 thermocycling 반응에서 전체 플라스미드를 확장하여 사용할 수 있습니다. 반응하는 동안 원래의 플라스미드에 불일치의 형태로 원하는 돌연변이를 운반 mutagenic primers는, 새로 합성 플라스미드에 통합되어 있습니다. 반응에서 원래 플라스미드의 제거 후 변이 플라스미드가 E.으로 변화 도착 이 방법의 돌연변이 효율이 100 % 없기 때문에 대장균. 다음 단계만을 심사 목적으로하고 있습니다. 전체 절차는 사흘 걸리지만 주요 부분은 하루 이내에 할 수 있습니다.

1.0 하루에 한 :

1.1 Thermocycling 반응 :

원본 플라스미드 : 돌연변이 유발 프로토콜을 감독이 사이트 10킬로바이트까지 plasmids와 함께 잘 작동됩니다. 큰 Plasmids이 방법으로 공격하는 조금 어려운 일부 인내와 th....

토론

사이트 감독 돌연변이 유발이 플라스미드에 의해 운반 유전자를 공격하는 빠른 방법을 제공하는 돌연변이 유발 - 방법입니다. 전체 반응은 하루에 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면, 그것은 단지 원하는 변이를 가지고 무료 primers 한 쌍의 등 Pfu - 효소로 교정 효소가 필요합니다. 새로 합성된 플라스미드는 제한 효소 DpnI와 반응을 소화하여 부모의 플라스미드 분리 수 있습니다. 이 효소는 methylated DNA를 요약. 따라서 오직 새로 합성 플라스미드는 변형하실 수 있습니다. 이 튜토리얼에서 우리는 수제 돌연변이 유발 키트를 사용하여 사이트 이동 돌연변이 유발을 수행 보여주었다. 이 키트의 장점은 효과가 남아있는 동안 절약 비용입니다. 이 방법의 중요한 포인트는 뇌관 디자인과 어닐링 온도입니다. 경우에는 새로 합성 DNA가 전기 후, 방법의 실패를 표시 할 수있는, 하나는 박테리아의 변환에 대한 전체적인 반응과 사용을 촉진하기 위해 시도할 수 시각 수 없습니다. 그러나이 문제를 해결하는 가장 좋은 방법은 어닐링 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Pfu polymerase (재조합 또는 천연형)	Fermentas	EP0571 또는 EP0501
dNTP mix 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI 또는 DpnI Fast digest	Fermentas	ER1701
프라이머	Invitrogen		탈염 처리됨