organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.
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이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
관찰하고 역동적인 세포 과정을 특성화하는 것은 정적인 이미지에서 얻은 수없는 세포 활동에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 바이탈 형광 프로브, 특히 녹색 형광 단백질 (GFP)은 특정 세포내 구획과 세포 구조를 분류하는 능력에서 형태소 분석 세포 생물학 혁명을했습니다. 예를 들어, GFP (및 그 변종 스펙트럼) chimeras의 라이브 영상이 생물과 세포 유형 [1-3]는 수많은에 cytoskeleton, organelle 전송 및 멤브레인 역학의 동적 분석을 위해 사용할 수있다. 라이브 영상이 널리 사용되고 있지만,이 방법은 여전히 특히 기본 교양 뉴런에서 많은 기술적인 도전, 포즈. 하나의 문제는 사후 mitotic의 뉴런에 GFP - 태그 단백질의 표현이며, 다른 하나는 photobleaching, 일반 세포의 건강을 유지, phototoxicity을 최소화하면서 형광 이미지를 캡처하는 능력입니다. 여기 우리는 그러나 완전히 양극 뉴런의 이미징에 이상적입니다, 상대적으로 낮은 transfection 속도 (~ 0.5 %) 산출 지질 기반 transfection 방법을 설명하는 프로토콜을 제공합니다. 단일 axons과 dendrites가 anterograde 대 역행 교통, 즉의 방향을 확인하는 세포 기관에 자신의 방향으로 특성화 할 수 있도록 낮은 transfection 속도가 필수적이다. 뉴런을 표현하는 영상 GFP에 대한 우리의 접근 방식은 CCD 카메라, 이미지 캡처 소프트웨어 및 온수 영상 챔버와 복 표준 넓은 필드 형광 현미경에 의존합니다. 우리는 특별한 광학이나 형광등 광원 이외의 여기 조건없이 예를 들어, 고밀도 코어 vesicles, mitochondria, 성장 콘, 그리고 굴지 organelles 또는 구조의 다양한 몇 군데 있습니다. 또한 spectrally - 별개의, 찬란 표시된 단백질, 예를 들면, GFP 및 dsRed - 태그 단백질은, 공동 운송 또는 다른 조정 세포 이벤트를 특성화 동시에 가까운 시각하실 수 있습니다. 여기에 설명된 이미징 접근 이미징 어플 리케이션의 다양한 유연하고 상대적으로 작은 비용 실험실 채택 수있는 것은 현미경을 사용할 수있는 제공됩니다.
프로토콜
1 부 : Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 뉴런의 Transfection
장비 설정 :
쥐 또는 마우스 hippocampal 뉴런은 Kaech와 뱅커, 2006에 따라 양식은 [4]. transfections에 사용되는 전형적인 세포 밀도는 250,000 cells/6-cm 요리입니다. 필요한 시약 및 장비 50 MM kynurenic 산성, 일반 benchtop 튜브 홀더, benchtop 쿨러를 (최고 Lipofectamine 시약의 추위를 유지하는) 포함
Lipofectamine 시약, 멤, microfuge 튜브, micropipetters 및 멸균 포셉.
절차 :
- 각 transfection 레이블을위한 두 1.5 ML 튜브, 플라스미드 DNA의 transfection 시약을 포함 한를 포함 하나. 다음 incubations은 실온에서 진행할 수 있습니다.
- 한 튜브 100 μL 멤와 플라스미드 DNA를 1.0 μg을 결합 (모든 종류의 보충없이, 멤은 equilibrated 산도의 온도가 필요하지 않습니다.)
- 다른 1.5 ML 튜브 100 ....
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토론
라이브 셀 이미징은 교양 뉴런의 organelle 운송의 직접 관찰하기 위해 도전하지만, 강력한 기술입니다. 어려움 문화 합병증으로 인해 가난한 사람의 신경 세포 건강과 절차의 상류 발생할 수 있습니다. 따라서, 세포 건강 (예제 심판을 참조하십시오. 4) 성장 매체의 조직 문화 라이트 현미경을 사용하는 동안 coverslips을 준수하여 transfection 이전과 이후 평가해야합니다. 전송의 과정을 신경 세포를 포함하고있는 영상 실로 coverslips하면 세포에 스트레스, 따라서 그것은 coverslips을 조작하면주의를 운동하는 것이 중요합니다. 건강 보이는 세포가 프로 시저에서 지연이나 영상 매체의 장비 또는 평균의 불완전한 미리 가열로 인해 어떤 교통 수단을 표시하지하는 것은 일반적인 수 있습니다. 교통 분석을위한 axonal와 돌기 방향을 알 수 있어야합니다, anterograde과 역행 수송을 구별 즉. 그것은 따라서 세포 기관의 위치 결정 및 연속의 연결 세그먼트는 세포 기관에의 관심 지역을 연결하는 볼 수 .......
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감사의 글
우리는이 원고들의주의 읽기위한 해럴드 허터과 헬레나 데커 감사드립니다. 우리는 또한 자신의 전문 지식에 대한 Leica Microsystems에서 등록 Sidhu 감사합니다. 이 연구는 국립 과학 및 캐나다 공학 협의회, 수상 # 327100-06, 과학의 사이몬 프레 이저 대학의 학부에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| Earle salts 및 L-glutamine 함유 MEM-Eagle | 시약 | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | 시약 | Invitrogen | 11668-027 | 형질전환 시약 |
| Ca2+ 및 Mg2+ 함유 10X Hanks | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | 실시간 이미지 촬영 배지 |
| 1M HEPES | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 15630-130 | 실시간 이미지 촬영 배지 |
참고문헌
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective trans....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.
Posted by JoVE Editors on 1/20/2010. Citeable Link.
A correction was made to Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:
David M. Kwinter, Michael A. Silverman
instead of:
David Kwinter, Michael Silverman.
