이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
주요 histocompatibility 복합 (MHC) 클래스 II의 tetramers은 항원 특정 CD4의 직접적인 시각화 + 유동세포계측법에 의해 T 세포 수 있습니다. 이 방법은 펩타이드로드 MHC와 해당 T - 세포 수용체 사이의 매우 구체적인 상호 작용에 의존합니다. 하나 MHC / 펩티드 분자의 친화력이 낮은 반면, 교차 연결 streptavidin과 MHC / 펩타이드 단지하면 시약을 얼룩로서 사용할 수 있도록, 상호 작용의 욕망을 증가시킵니다. 때문에 CD4 + T 세포 (단일 특이성을위한 300,000의 ~ 1)의 상대적으로 낮은 주파수의 분석은 검출 자사의 한계를 높이기 위해 체외 증폭 단계에서을 활용합니다. Mononuclear 전지는 Ficoll의 밑받침에 의해 말초 혈액 정화됩니다. CD4 + 세포는 다음 biotinylated 항체 칵테일 및 안티 - 비오틴 분류 자석 구슬을 사용하여 부정적인 선택으로 구분됩니다. 항원은 세포, CD4 + T 세포가 antigenic의 펩타이드와 IL - 2를 추가하여 미디어 확장된다 제시로 CD4 세포 분획에서 자기편 세포를 사용합니다. 확대 세포 한 시간 동안 37 C의 잠복기와 이후 스테인드 같은 안티 - CD4, 안티 인 경우에는 3 번 CD, 및 안티 CD25와 같은 표면 항체를 사용하여 해당 클래스 II tetramer 물들일 수 있습니다. 라벨 후, 세포를 직접 유동세포계측법으로 분석하실 수 있습니다. tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 확장된 CD4 + 세포들 사이에 뚜렷한 인구를 형성합니다. Tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 CD25 아르 +와 CD4 종종 높은. 배경 tetramer의 얼룩의 수준이 다를 수 있기 때문에, 긍정적인 얼룩 결과는 항상없는 tetramer와 같은 세포의 얼룩에 비해해야합니다. 이 기본 분석의 여러 변형이 가능합니다. Tetramer 긍정적인 세포는 더욱 phenotypic 분석, ELISPOT 또는 확산 assays에 포함 또는 기타 보조 assays에 대한 정렬 수 있습니다. 몇몇 그룹은 또한 tetramers 및 안티 시토킨 또는 방지 FoxP3 항체 중 하나를 사용하여 공동 얼룩을 증명하고있다.
프로토콜
1. 주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC) 절연
- 혈액 샘플을 구합니다 - 피를 주사기 혹은 혈액 튜브의 수집과 염증을 방지하기 위해 헤파린 (1시 50분 비율)과 함께 안티 coagulated해야합니다. 약 1 × 혈액 ML 당 10 6 PBMC의 수율을 기대 - CD4 양성 (CD4 +) T 세포 될 약 40 % 중.
- 50 ML 원뿔 튜브, 튜브 당 25 ML로 나누어지는 혈액을. 혈액이 분리된 경우, 부드럽게 플라즈마를 배포하기 전에 aliquoting 믹스
- , 40 ML과 Ficoll 11 ML을 그림으로써 밑받침으로 전체 볼륨을 가져 혈액 튜브에 삽입하고, 조심스럽게 피펫에서 pipet 보조를 제거, PBS를 추가합니다. ficoll 천천히 튜브의 바닥에 배수됩니다. 수준이 같도록되면 서서히 혈액 튜브에서 피펫을 제거하고 폐기.
- 혈액 튜브를 모자 Aerosolve 용기로 이동합니다. 노 브레이크 - 단단히 900의 용기와 원심 × g 20 분 동안을 닫습니다. 그것은 제동 힘은 세포의 레이어를 방해하므로 아무런 제동이 스핀의 끝에 적용되지 않습니다 것이 중요합니다.
- 스핀 후 PBMCs는 노란색 플라즈마 (위)와 투명 ficoll (아래) 사이에는 뚜렷한 흰색 레....
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토론
면역의 CD4의 역할 + T 세포를 이해하는 것이 근본적으로 중요하다. 그러나, 특정 항원 CD4 + T 세포가 감지하고 전통적인 방법을 사용하여 분리하기가 어려울 수 있습니다. 대조적으로, MHC 클래스 II의 tetramers 원하는 항원 특이성과 CD4 + T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다. 이 동영상은 고립, 정화하고, CD4 + T 세포와 tetramers를 사용하여 후속 시각화의 체외 증폭에을 보여줍니다. 클래스 II의 Tetramers은 가용성 biotinylated 클래스 II α / 형광 표시 streptavidin 코어 (그림 4) 주변에 복합 β dimers 구성된 형광 단백질 conjugates 있습니다. 이 동영상에 사용되는 tetramers은 곤충 세포 배양 (1)를 사용하여 Benaroya 연구소에서 Teramer 코어 연구소에 의해 생산되었다. 이러한 tetramers는 0.5 MG / ML 솔루션으로 준비하고 6-18개월 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 동결 - 해동의 스트레스가 stept.......
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감사의 글
우리는 촬영 및 비디오 제작에서 중요한 역할 딕 폴리와 레이 킴볼 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 2등급 층류 생물안전작업대 | 장비 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | 또는 동등 제품 |
| 50 mL 원추형 튜브 | 장비 | VWR international | 47747-182 | 또는 동등 제품 |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | 시약 | Hyclone | SH30028.02 | 또는 동등 제품 |
| Ficoll-paque PLUS | 시약 | GE Healthcare | 17-1440-03 | 차광을 위해 알루미늄 호일로 감쌈 |
| Pipet Aid XP | 장비 | Drummond Scientific | 4-000-101 | 또는 동등 제품 |
| 10 mL 피펫 | 장비 | Corning | CLS4492 | 또는 동등 제품 |
| Aerosolve 캐니스터 | 장비 | Beckman Coulter Inc. | 359481 | 50 mL 인서트 포함 |
| 원심분리기 | 장비 | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | 또는 동등 제품 |
| 전송 피펫 | 장비 | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | 또는 동등 제품 |
| 파스퇴르 피펫 | 장비 | VWR international | 14672-200 | 또는 동등 제품 |
| 용혈 버퍼 | 시약 | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | 시약 | Sigma-Aldrich | T6146 | PBS 내 0.2% |
| 혈구계수기 | 장비 | VWR international | 15170-208 | |
| 15 mL 원추형 튜브 | 장비 | VWR international | 05-527-90 | 또는 동등 제품 |
| 런닝 버퍼 | 시약 | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T 세포 분리 키트 II | 시약 | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | 또는 동등 제품 |
| EasySep® 자석 | 장비 | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL 폴리프로필렌 튜브 | 장비 | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | 시약 | Invitrogen | 22400-089 | 25 mM HEPES 포함 |
| 혼합 인체 혈청 | 시약 | N/A | N/A | 건강한 기증자로부터 채취, 열 불활성화 및 여과됨 |
| Pen Strep | 시약 | Invitrogen | 1570-063 | 또는 동등 제품 |
| 500mL 0.22 micron 병 상단 필터 | 장비 | Nalge Nunc international | 595-3320 | 또는 동등 제품 |
| 48-웰 플레이트 | 장비 | Costar | 3548 | 또는 동등 제품 |
| 37°C CO2 배양기 | 장비 | Sanyo | MCO-18AIC | 또는 동등 제품 |
| 20 mg/mL 합성 펩타이드 | 시약 | N/A | N/A | 임의의 펩타이드 공급업체에서 맞춤 합성 |
| 5 mL FACS 튜브 | 장비 | Falcon BD | 352008 | 폴리스티렌 |
| 펩타이드 로딩 class II 테트라머 (설명된 바와 같음) | 시약 | N/A | N/A | BRI 테트라머 코어에서 준비함 |
| Anti-CD3 | 시약 | BD Biosciences | 347344 | 또는 동등 제품 |
| Anti-CD4 | 시약 | eBioscience | 17-0049-73 | 또는 동등 제품 |
| Anti-CD25 | 시약 | eBioscience | 11-0259-73 | 또는 동등 제품 |
| Facs Calibur 유세포 분석기 | 장비 | BD Biosciences | 342975 | 또는 동등 제품 |
참고문헌
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W.
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