우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 2 부

요약

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 2.

프로토콜

1 부 : RNA로부터 cDNA 합성

1. 앰비온 아미노 알릴 MessageAmp II 키트를 사용하기 전에, 세척 버퍼에 100 % 에탄올의 권장 볼륨을 추가합니다.
2. PCR 반응 관에서 T7 oligo (DT) 프라이머 총 RNA 및 1μl의 5μg을 100ng 사이를 추가합니다. nuclease 무료 물로 12μl에 볼륨을 가져와.
3. 70 샘플을 품어 ° C thermocycler 10 분.
4. ° C와 원심 분리기 간략 70 RNA 샘플을 제거합니다. 얼음 놓습니다.
5. 1 ^{일 스트랜드} 합성 마스터 믹스를 준비하고 (오류 pipetting 10 % 없더군요)를 실온에서 보관. (표 1)
6. 부드럽게 피펫 마스터 믹스이나 제스처는 혼합 후 간단히 원심 분리기.
7. 각 RNA 샘플을 마스터 믹스 8μl을 전송합니다. 3-4 회를 아래와 pipetting하여 섞는다.
8. thermocycler 2 시간 동안 42 ° C에서 알을 품다.
9. 얼음 원심 분리기 샘플의 잠시 장소. 즉시 dsDNA 합성의 다음 단계로 진행합니다.
10. 얼음 2 ^차 스트랜드 합성 마스터 믹스 (오류를 ....

토론

중요 단계

배열 데이터에 편견이 관찰되었습니다로서 증폭의 두 번째 라운드는 권장되지 않습니다. 각 효소 단계 (1 ^일 및 2 ^차 가닥 cDNA 합성, IVT)에서 신중하게 혼합하는 것은 각 단계의 효소 배양은 적절한 온도는 좋은 증폭 수율을 얻는 것이 중요합니다. 도 편차를 공기 하이브 리다이 제이션 오븐이나 물 목욕 하이브 리다이 제이션에서 IVT 중 2-3 도까지처럼 작고 크게 증폭 제품의 수율에 영향을 줄 수 있습니다 - 온수 조절 뚜껑이있는 PCR의 자전거 타는 사람이 좋습니다.

신청 / 의의

이 프로토콜에서 발생하는 분류 RNA는 문화에 감염된 세포에 유전자 표현 반응을 평가하기 위해 인간, 바이러스, 또는 사용자 정의 microarrays에 hybridized 수 있습니다. Microarray 플랫폼 다양하므로 표시된 프로브에서 하.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Amino Allyl MessageAmp II aRNA 증폭 키트	시약	Applied Biosystems	AM1753	20회 반응용
Amino Allyl MessageAmp II aRNA 증폭 키트	시약	Applied Biosystems	AM1821	100회 반응용, 96-well 포맷
NanoDrop ND-1000 UV-VIS 분광광도계	기타	NanoDrop	ND-1000	또는 동등한 성능의 분광광도계