FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

요약

소포 자료의 속도론을 측정하는 능력은 neurotransmission의 기초의 일부에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 hippocampal의 연결을 문화에 presynaptic 소포 릴리스의 속도를 측정하기 위해 빨간색 형광 염료 FM 4-64으로 표시 vesicles의 실시간 이미지를 사용합니다.

초록

소포 자료의 속도론을 측정하는 능력은 neurotransmission의 기초의 일부에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 presynaptic 소포 릴리스의 속도를 모니터 FM 염색으로 표시 vesicles의 실시간 이미지를 사용합니다. FM4 - 64은 endocytosis가 자극을 그대로 시냅스 vesicles의 점막에 내장 적색 형광 amphiphilic styryl 염료이다. Lipophilic 상호 작용은 염료가 크게 vesicles 및 소액 하나 세포외액에와 연관된 경우 따라서 밝은 신호를 방출, 형광의 증가 원인. 세척 단계는 플라즈마 막 내에서 외부 염료를 제거하는 데 사용 후 남은 FM은 vesicles 내에 집중되고 exocytosis이 전기 자극의 또 다른 라운드로 유도하면 다음 퇴학입니다. vesicles 릴리스의 속도는 형광의 발생 감소에서 측정됩니다. FM 염료가 transiently 외부 적용 될 수 있기 때문에 transfected 시냅스와 인접 제어 부튼스 간의 가격을 비교 특히, 문화의 연결에 exocytosis의 속도를 결정하기위한 유용한 도구입니다.

프로토콜

셀 : 쥐 (또는 마우스) 기본 hippocampal의 연결을 문화 (체외에서 14~28일).

자극 : 전기, 두 백금 전극을 통해 전달; 70-90 MV

현미경 : 거꾸로 CCD 형광 현미경에서 60x 기름 렌즈.

소프트웨어 : Slidebook (지능형 이미징 혁신, 산타 모니카, CA)

자세한 내용은 보충 방법 페이지를 참조

1. 따뜻한 HEPES 버퍼 상온에 호수 (HBS). 글루 탐 산염 수용체 antagonists APV (50 μm의 최종 농도)와 CNQX (10 μm의 최종)를 추가합니다. 각각의 FM 실험은 보통 20-30 ML HBS가 필요합니다. 10 μm의 FM 4-64 (분자 프로브)의 농도를 작업하기 위해 (antagonists가 추가로) HBS의 주식 솔루션 1:1000을 희석. 각 실험 2 ML FM soln하십시오. 빛의 노출을 방지하기 위해 호일로 솔루션을 커버.
   
   
2. 전극 챔버에 신경을 포함하고있는 coverslip를 탑재합니다. 챔버의 미디어 챔버 상단과 수준임을 확인하고 완전히 전극....

토론

300 행동 잠재력 (APS)는 소포 재활용 중 적어도 한 라운드, 300 APS 이상이 자주 라벨 vesicles의 재활용 풀에 주어진다의 로딩 자극을 유발하기에 충분 때문입니다. 같은 900 APS와 같은 강렬한 로딩 자극은, 표시되는 추가 vesicles의 호칭 번호를 허용할 수도 있지만, 이것은 또한 큰 불특정 얼룩에 이르는, 염료가 세포 세포막에 포함할 수있는 시간의 양을 증가시킵니다. 나는 적절한 destaining을 위해 중요한로 세척 단계를 발견했다. 보통 10 유량 분당 1-1.5 ML, + 2 분 perfuse하는 것이 중요합니다. 하나의 이미지는 염료 제거의 정도를 모니터링하는 ~ 7 분 세척으로 촬영하실 수 있습니다. 필요한 경우, 유량 및 또는 세척 시간은 약간 증가 수 있습니다. 실험을 위해 이것이 세포가 휴식을 경우에도 발생할 수 있습니다 자연 exocytosis 이벤트를 통해 소포 - 라벨링을 잃는의 가능성을 증가 10~12분보다 진행하기 위해 세척을 위해 바람직하지했다. destaining 단계에 대한, 900-1200 APS는 모든.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
APV	Sigma-Aldrich	A5282
FM 4-64	Molecular Probes, Life Technologies	T-3166
CNQX 이나트륨염	Sigma-Aldrich	C-239