호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 파트 3 찬란 염료의 아미노 알릴 결합에 의해 두 호스트 및 바이러스 샘플에서 증폭된 RNA를 라벨링 과정을 설명합니다. 3 부 3.
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이 논문에서
요약
프로토콜
1 부 : 아르나 라벨 : 염료의 아미노산 알릴 커플링
- 1.5mL microcentrifuge 튜브에 아르나 샘플 1μg을 추가합니다.
- 그들이 완전히 건조되기 전까지는 낮은 여부 열에 샘플을 건조 진공. 바로 그것이 건조 각 튜브 캡 - overdry 마세요!
- 각각의 튜브에 9μl 커플링 버퍼를 추가하고 부드럽게 1 분 vortexing하여 아르나을 resuspend. 튜브의 맨 아래에있는 샘플을 수집하기 위해 간략하게 원심 분리기, 다음 예제는 얼음에 앉아 보자.
- Cy3 또는 Cy5 염료의 각 튜브에 22μl 고품질의 DMSO를 추가합니다. 염료 중 하나 튜브 충분이 샘플입니다. Cy3의 염료가 참조 샘플 라벨을위한, 그리고 Cy5의 염료는 테스트 샘플 라벨입니다.
- 철저하게 혼합하기 위해 염료 소용돌이. 사용할 준비가 될 때까지 어둠 속에 염료 보관하십시오. 사용하기 전에 이전 1시간보다 염료를 준비하지 마십시오. 물이 언제든지 염료 / DMSO 혼합에 도착하지 있는지 확인하십시오.
- 각 샘플에 대한 준비 DMSO / 싸이 염료의 11μl를 추가합니다. 부드럽게 vortexing하여 잘 섞는다.
- 상온에서 30~45분에 대한 부화. 석박....
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토론
중요 단계
아미노 알릴 커플링을 수행할 때, 그것은 결합하기 전에 바로 DMSO (미만 1 시간)에 염료를 resuspend하고 염료에있는 활성 그룹과 반응하므로 물이, 염료 / DMSO 혼합에 도착하지 않도록하는 것이 중요합니다. RNA (1 - 2uL보다는 완전히 건조까지 건조 가능) overdry 및 커플링 버퍼에 잘 resuspend하지 마십시오. 커플링 반응하는 동안, 가끔 flicking과 함께 어둠 속에서 반응을 유지하고 필요할 경우 스핀 다운.
신청 / 의의
이 프로토콜에서 발생하는 분류 RNA는 문화에 감염된 세포에 유전자 표현 반응을 평가하기 위해 인간, 바이러스, 또는 사용자 정의 microarrays에 hybridized 수 있습니다. Microarray 플랫폼 다양하므로 표시된 프로브에서 하이브 리다이 제이션 혼합물의 준비에 대한 제조 업체의 지침을 따르시기.......
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공개 사항
저자들은 공개할 이해관계가 없음을 밝힙니다.
감사의 글
화이트 헤드 연구소 펠로 자금
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | 시약 | GE Healthcare | RPN5661 | Cy3 및 Cy5 염료 모두 포함 |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS 분광광도계 | 기타 | NanoDrop | ND-1000 | 또는 동등한 성능의 분광광도계 |
참고문헌
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickso....
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