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방법 논문

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

14.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/1178

⸱

2009년 5월 18일

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Anesthesiology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Anesthesiology, Medicine and Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

이 논문에서

요약

우리는 ATP - 문이 P2X2 수용체의 전체 길이 C 터미 너스에 바인딩 뇌 단백질을 식별하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 모든 P2X 수용체에 대한 확장 및이 방법의 체계적인 응용 프로그램은 P2X 수용체 신호의 더 나은 이해로 이어질 것으로 예상된다.

초록

리간드 - 게이 티드 이온 채널은 신경계 1 시냅스 커뮤니케이 션을 기초. 포유 동물에서 리간드 - 문이 채널의 세 가족이 있습니다 cys 루프, 글루 탐 산염 - 게이 티드과 P2X 수용체 채널 2. 각각의 경우에 송신기의 바인딩은 이온들이 전기 그라디언트를 흘러이를 통해 기공의 개통에 이르게한다. 많은 리간드 - 문이 채널은 또한 하류 채널 개방 시간을 초과할 수 있습니다 역할 5 (예 : 유전자 규정)을 신호가 칼슘 이온 3, 4에 투과 수 있습니다. 따라서 리간드 - 문이 채널 몇 밀리초에서 일에 이르기까지 광범위한 시간 단위 이상의 신호 수 있습니다. 그것이 자신이 단백질에 의해 규제하는 방법 리간드 - 게이 티드 이온 채널을 이해하기 위해 필요하며, 어떻게 이러한 단백질이 중요한 역할을 감안할 때하면 신호를 조정할 수 있습니다. 최근 연구 많은 경우 전부는 아니 채널이 단백질 신호 단지 6 일부가 될 수있다하는 것이 좋습니다. 이 문서에서 우리는 P2X2 수용체 cytosolic 도메인의 C - 말단 부분에 바인딩 단백질을 식별하는 방법에 대해 설명합니다.

P2X 수용체는 ATP - 게이 티드 양이온 채널이 일곱 subunits (P2X1 - P2X7)로 이루어져 있습니다. P2X 수용체 널리들이 흥분성의 시냅스 전송 및 신경 전달 물질 릴리스 7 presynaptic 촉진을 중재 두뇌에 표현됩니다. P2X 수용체는 고르기가 아닌 고르기 세포에서 발견의 연결 신호, 염증과 심장 혈관 기능 8 키 역할을 중재하고 있습니다. P2X2 수용체는 신경계 9 풍부하고 본 연구의 초점입니다. 각 P2X의 subunit는 세포외 지역 7 세포내 N과 C 테르 (그림 1A) 7로 구분이 멤브레인 스패닝 세그먼트를 (TM1 & TM2) 소유로 생각됩니다. P2X의 subunits 10 (P2X1 - P2X7)는 아미노산 수준 11시 30~50% 시퀀스 상동을 보여줍니다. P2X 수용체가 ionotropic 수용체 중에서 가장 단순한 stoichiometry는 단지 세 subunits를 포함합니다. P2X2의 C - 말단 120 아미노산 (그림의 1B)로 구성되어 있으며, P2X2 수용체는 신호 단지의 일부가 될 수있는 가설을 지원하는 여러 단백질 도킹 합의 사이트가 포함됩니다. 몇 가지 기능이 P2X2 수용체 9 C - 말단에 기인하고 있지만 그러나, 연구는 분자 파트너 설명도 없어 그 전체 길이 C - 말단을 통해이 단백질의 세포 내쪽으로 몇 가지. 이 방법은 종이에 우리는 전체 길이 P2X2 수용체의 C - 말단과 상호 작용하는 단백질을 식별할 수있는 proteomic 방법을 설명합니다.

프로토콜

실험 절차

실험 절차 (그림 2) 아래 단계 현명한 방식으로 설명하는 네 부분으로 구성되어 있습니다.

1 부 : P2X2 수용체의 C - 말단의 Subcloning, 그리고 표현.

우리는 바인딩하는 뇌 단백질을 식별하는 전체 길이 박테리아 P2X2 수용체의 C - 말단을 표명했습니다.

  1. P2X2 수용체 (그림 1)의 C ​​- 말단은 (잔류물 353-472) pGEX 4NT1 (GE 생명 과학)로 복제 및 시퀀싱과 검증, PCR에 의해 증폭되었다.
  2. 재조합 플라스미드가 E.으로 변화되었다 재조합 단백질의 표현에 대한 대장균 (BL21).
  3. 플라스미드 P2X2 CT - GST를 포함하는 박테리아 (E. 대장균 BL21)의 글리세롤 주식은 멸균 피펫 팁과 스크랩한 적합 선택적 마커 (50 G / ML 암피실린)와 함께 Luria - Bertani (LB) 미디어 5 ML에 주사했다 37C에서 궤도 통에 하룻밤 incubated.
  4. 600 nm의에서 광학 밀도가 도착할 때까지 밤새 재배 문화는 적절한 항생제 (50 μg / ML 암피실린)와 LB 미디어 250 ML에 주사하여 37C에서 2-3 시간 250 rpm으로 궤도 통에 incubated되었습니다 ~ 0.6-0.7.
  5. 문화 IPTG의 1 ㎜로 유도 나아가 단백질 표현을위한 3 시간을 위해 37C에 incubated했다.
  6. 문화 다음 4C (문화의 1ml이 표현 수준을 분석 저장하고 '유도'로 표시했습니다) 15 분 5천그램에 소용되었다. 뜨는은 폐기되었으며 펠렛은 살린 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (인트) 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ㎜의 산도 8.0) 20 ML에 resuspended되었습니다.
  7. 정지 50 ML 팔콘 튜브에서 15 분 5,000g에 소용되었다. 뜨는은 폐기되었으며 세미 드라이 펠렛은에 - 70C가 하룻밤 냉동했다.
  8. - 70C 펠렛은 얼음 차가운 용해 완충액 (2 % (W / V) sarkosyl 15 MG 라이 소 자임, 150 MM NaCl, 트리스 pH7.5 50 MM, 5 MM의 DTT 완벽한 테아제 억제제 정제) 40 ML에 resuspended되었습니다 그리고 정지 30 분 얼음 incubated되었습니다. 이 부화하는 동안, 3 ML 글루타티온 - 세파 로스 4B 비즈는 인산 버퍼 살린 (PBS)과 PBS 다음 20 ML T - PBS (0.1 % (V / V) PBS에서 tritonX - 100) 20 ML로 세탁했다. 비즈는 1 ML PBS에서 resuspended되었습니다.
  9. 세균 현탁액 액체 질소에 3 번 동결 - 해동 및 sonicated (1S ON / OFF, 얼음 3 분 30 마이크론)와 추가 4퍼센트 30 분 (V / V) 트리톤 X - 100, 10 MM MgSO에 대한 incubated되었습니다 4 얼음 2 MM ATP.
  10. lysate는 (펠렛 1 뜨는의 ML cytosol과 세포막에있는 단백질의 양을 테스트 SDS 페이지에 저장된에서 샘플) 삭제되었습니다 4C 및 펠릿 15 분 2만그램에 소용되었다. 뜨는은 1 시간 (또는 야간) 4C에 대한 주판으로 incubated했다.
  11. 구슬은 5 분 500g에 늘인되었으며 뜨는가 (예제는 언바운드 분율 저장되었습니다) 삭제되었습니다. 구슬은 T - PBS 다섯 번 (세척은 세척 컨트롤에 대한 저장된)로 세탁했다.
  12. 구슬 그런 다음 50 % (W / V에게) 슬러리를 제공하기 위해 PBS에 resuspended 및 사용까지 4C에 냉장고에 저장되었습니다. 단백질 농도는 브래드 분석 (제조 업체의 지침에 따라)에 의해 추정되었다.

2 부 : 전체 두뇌 lysates의 준비

P2X2 수용체가 다량으로 뇌 8 표현하는 것으로 알려져 있습니다. 현재 분석에서 우리는 쥐의 뇌 전체 lysates (그림 3)에서 P2X2 수용체와 상호 작용하는 단백질을 식별하는 모색.

  1. 성인 쥐 두뇌는 수확 (동물 UCLA IAACUC 승인 프로토콜에 따라과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 희생되었다)와 즉시 얼음 차가운 PBS (3 배)을 씻어서했습니다.
  2. 10 ML (수확 뇌의 ~ 5 배 젖은 무게) 150 MM를 포함하는 얼음 차가운 용해 버퍼의 NaCl, 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM EGTA, 1 MM NaF, 1 ㎜ 셀을 lyse하기 나 3 할머니 4, 1 ㎜ PMSF, 5 류펩틴의 μg / ML, 1 % (V / V) NP - 40, 그리고 프로 테아제 억제제 칵테일의 정제는 수확 두뇌에 추가되었습니다.
  3. 균질 일관성의 혼합물이 달성되기 전까지는 뇌 조직은 유리 다운스의 균 질기와 얼음 homogenised되었습니다.
  4. 세포 lysate은 깨지지 세포를 제거하는 5 분 2,000그램에 소용되었다. 뜨는은 그대로 organelles 및 멤브레인 집계를 제거하는 60 분 2만9천g에서 다시 수집 소용되었다.
  5. 즉시 원심 분리 후 뜨는은 깨끗한 튜브로 이송되었다. 전체 뇌 lysate의 단백질 농도는 브래드 포드 분석에 의해 측정되었다 (보통 ~ 15 MG / ML).
  6. lysate는 aliquoted과에서 - 70C 저장되었습니다.

파트 3 : P2X2 C - 꼬리 관련 단백질의 분리

전체 뇌 lysates에서 P2X2 CT - GST의 바인딩 파트너를 식별하려면 분석 아래로 끌어가 CT - G를 사용하여 수행되었습니다ST 미끼로 글루타티온 세파 로스 4B 비즈를 고정. 컨트롤, 구슬로 바운드 혼자 GST를 사용했습니다.

  1. 브레인 lysate는 4C에서 1 시간에 대한 GST 비즈와 precleared했다. 펠렛은 폐기되었으며 뜨는은 추가 분석을 위해 사용되었다.
  2. GST와 P2X2 글루타티온 세파 로스 4 B 비즈에 바운드 CT - GST (10 μg)의 동등한 양의 용해 버퍼에 4C에서 회전, 쥐의 뇌 전체 lysate에서 precleared solubilised 단백질 100g과 함께 하룻밤 incubated되었습니다.
  3. 비즈 5 분 1천g에 늘인되었으며 뜨는가 삭제되었습니다.
  4. 구슬은 용해 버퍼와 한번 세탁하고 수정 Laemli 버퍼에 삶은되었습니다 [4 % (W / V) SDS, 10 % (V / V) 2 - 메르 캅 토 에탄올, 2 % (V / V) 글리세롤, 0.004 % (W / V) bromophenol 청색과 0.125 M TrisCl 산도 6.8] 5 분.
  5. 샘플은 5 분와 10 % SDS - PAGE (그림 4)로 구분하여 뜨는 위해 5,0​​00그램에 소용되었다. 젤은 SYPRO 루비 단백질 얼룩 젤 (제조 업체의 지시에 따라)과 자외선을 시각 물들일되었습니다. P2X2 CT - 관련 단백질은 미끼로 GST - NULL을 사용하여 복구 사람과 비교했다. 네 생물 학적는 (4 머리과 네 개의 독립적인 끌어 오기 때로는 IE) 수행되었습니다 복제합니다.

4 부 : 단백질의 식별.

겔 전기 영동에 의해 분리된 단백질은 젤에서 excised 및 질량 분석법 12 확인되었습니다 참고 :. 프로세스 전반에 걸쳐 먼지의 부재는 각질 오염을 줄이기 위해 중요합니다. 실험자는 항상, 헤어 네트와 장갑을 얼굴 마스크를 착용하고 장갑을 사용하지 않고 관심의 겔 영역을 터치하지 않습니다.

  1. 아래 P2X2 당겨에서 발견한 모든 보이는 단백질 밴드는 깨끗한 면도날로 excised하고 (그림 4) 절단되었습니다. GST - NULL에 젤의 해당 영역 레인 풀다운도의 수준 아래의 단백질의 존재를 확보하기 위해 밴드 얼룩 (GST - NULL 미끼 특정 밴드도 excised 및 식별되었다)에 관계없이 동일한 방식으로 excised되었습니다 얼룩의 감도는보고되지 않았습니다.
  2. 겔 조각은 200 50 % 50 MM의 탄산수 소 암모늄의 μl (V / V) acetonitrile (ACN)과 RT 15 분 vortexed 튜브 incubated되었습니다. 이 세척 단계를 반복합니다.
  3. 겔 조각 200 μl acetonitrile (겔 조각이 수축 및 색상의 불투명 될한다)를 추가하여 탈수 있었다.
  4. Acetontrile 제거하고 젤 조각 ~ 10 분 speedvac에서 건조되었다.
  5. 겔 조각 그런 다음 조각을 담가에 신선한 10 MM MM DTT/10 트리스 (2 - 카르복시 - 에틸) 충분한 볼륨의 phosphine 하이드로 클로라이드 (TCEP) 30 μl와 incubated했다. 이것은 56C 물을 욕조에 30 분 남았는데.
  6. 다음 DTT 솔루션 100 μl 500 50 % acetonitrile 솔루션 MM의 탄산수 소 암모늄 및 ammounium의 중탄산염로 씻은 겔 슬라이스로 대체되었습니다.
  7. 세탁 솔루션은 aspirated과 acetonitrile 200 μl가 젤을 탈수에 추가되었습니다.
  8. Acetonitrile 그런 다음 제거 100 μl 신선한 100 MM의 iodoacetamide 솔루션 무료 sulfhydryls을 alkylate에 추가되었습니다. 이 단계는 어둠 속에서 실온에서 25 분 진행.
  9. Iodoacetamide 솔루션은 제거하고 vortexing하면서 겔 조각은 2 분 50 % acetontrile (산도 8.0) 50 MM의 탄산수 소 암모늄 200 μl로 세탁했다. 이 세척 단계가 반복되었다.
  10. 세척 용액을 제거한 후 겔 조각 그러면 ~ 10 분 대한 speedvac에 의해 제거되었습니다 200 μl acetonitrile와 incubated했다.
  11. 이 단계에서는 겔 조각은 트립신의 소화를 위해 준비가되어 있습니다. 젤 조각은 30 μl 트립신 용액 (20 μL / NG 작업 농도)에 incubated 잘 부푼 수 젤류 10 분 얼음에 배치했다. 초과 트립신은 제거하고 그들은 37C에서 12~16시간 위해 진행하는 허용했다 소화에 걸쳐 포장되어 보관 50 MM의 탄산수 소 암모늄 30 μl와 중첩 겔 입자를 rehydrated했다.
  12. 5 % 다섯 μl (V / V) 개미의 산성은 트립신과 체포 소화를 비활성화에 추가됩니다.
  13. 튜브는 ~ 15 분 vortexed 후 깨끗하고 표시 0.5 ML의 약병으로 전달했던 튜브의 바닥에 액체를 가지고 간단히 centrifuged했다.
  14. 그들은 단지 간단한 원심 분리로 구분하여, 10-15 분 두 vortexing 다음 적용 너무나도 50 % acetonitrile에 0.1 %의 향후 30 μl (V / V) 개미의 산성은 겔 조각에 추가되었습니다. 이 단계는 단계 사이의 산성 - acetonitrile 개미의 교체, 한 번 반복했다.
  15. 최종 액체는 하나의 약병에 제거하고 모든 추출 솔루션을 결합했다. 이 볼륨은 speedvac에서 ~ 30 UL로 축소되었다. 샘플은 현재 대량 분석법에 의해 반대로 위상 나노 액체 크로마 토그래피 및 단백질 식별을 위해 준비했습니다. 이 특정 예제에서,이 단계는 ThermoF에서 Orbi - 트랩 탠덤 질량 분석기에서 수행됩니다다른 모델 및 제조 업체의 악기가 쉽게이 시점에 설명된 방식으로 결합 수 있지만 isher (높은 질량 정확성, 단백질 검출을위한 빠른 듀티 사이클 일반적으로 강력한 운영 기능 선택).
  16. 대량 spectrometric 분석에 대한 자세한 내용 및 기준은 이제 간단히 소개하는 부분이있다. 모든 펩티드는 반대 위상 나노 LC (Eksigent)와 펩티드가 3 μl / 분 유량에서 C18 리버스 위상 칼럼에 로드된되었다로 구분되었다. 모바일 위상 0.1 % 개미 산성과 물에 2 % ACN했습니다, 모바일 위상 B는 0.1 % 개미 산성과 ACN 20 %의 물이되었다. 펩티드는 220 NL / 분 5 분 이상 95 % B로 다음 90 분 이상 50 % B로 5 % B에서 선형 그라디언트를 사용 유량에있는 기둥에서 eluted, 그리고 마지막 5 분 지속적인 95 % B를 유지했다 . 스펙트럼은 MS / MS 검사에 대한 MS의 검색 및 LTQ 사용되는 Orbi - 트랩과 함께 데이터 종속 모드로 인수되었습니다. 펩티드는 Bioworks 소프트웨어 패키지에 통합된 SEQUEST 알고리즘을 사용하여 쥐의 IPI 데이터베이스 v.3.53에 대한 스펙트럼을 검색하여 확인되었다. 각 펩티드는 다음 기준을 충족 : XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (3), 그리고 DeltaCN> 0.1. 단백질 식별에 사용되는 모든 스펙트럼은 수동 검사 및 채 2 펩티드가 확인되었을 때 어떤 단백질 허용되지 않았습니다. 단 단백질은 GST - NULL 끌어 오기 다운즈 동안 네 개의 P2X2 끌어 오기 양지 각각 결석 다음 현재는 추가 분석을 위해 고려되었다.

figure-protocol-1

그림 1. P2X2 수용체의 subunit의 도식 표현. A.이 만화는 P2X2 수용체의 subunit의 토폴로지를 보여줍니다. cytosolic 도메인 N과 C 테르 미니 (Termini)로 구성되어 있습니다. P2X2 수용체 (적색)의 C - 말단은 분석 풀다운을위한 미끼로 사용되었습니다. 본 연구에서 사용되는 P2X2 수용체의 C - 말단의 B. 아미노산 서열은.

figure-protocol-2

그림 2. 플로우 차트와 표현에 사용되는 프로토콜의 시간 라인, 정화는 풀다운 및 단백질의 식별. 우리는 시간 라인 프로토콜의 개요를 보여줍니다. 성인 쥐 두뇌 lysate은 즉시 assays 풀다운을 위해 사용하기 전에 신선 준비했습니다.

figure-protocol-3

그림 3. 쥐의 두뇌에 P2X2 C - 터미 너스 네트워크의 이진 proteomic 분석의 도식 표현. GST 비즈에 바운드 GST 단백질과 융합 P2X2 수용체의 C - 말단은 assays 풀다운을 위해 사용되었다. 브레인 lysate 준비되었고 단백질은 재조합 단백질 고정화와 incubated했다. 언바운드 분율은 용해 버퍼로 세탁했다. 단백질은 질량 분광법으로 확인되었습니다.

figure-protocol-4

그림 4. P2X2 수용체의 C - 말단의 바인딩 파트너의 식별. GST (파란색 상자)와 융합 수용체의 C - 말단과 상호 작용하는 단백질 putative의 스펙트럼을 보여주는 Sypro 스테인드 젤. 혼자 혼자 GST (노란색 상자)과 글루타티온 세파 로스 비즈에 대한 컨트롤 차선도 표시됩니다. 화살표 대량 분석법에 의해 더 분석을위한 excised되었습니다 독특한 밴드의 예를 나타냅니다.

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토론

이온 채널은 필수적인 멤브레인 단백질의 주요 클래스입니다. 그들은 선택적으로 플라즈마 막 걸쳐 자신의 전기 그라디언트 아래 이온의 움직임을 허용 물이 가득 모공이 포함되어 있습니다. 개방과 폐쇄 상태 사이의 이온 채널 게이트. 게이팅 단계 P2X의 리간드 게이 티드 이온 채널의 경우에는 송신기 (예 : ATP)에 의해 트리거됩니다, 또는 그것은 다른 단백질과 상호 작용에 의해 규제 수 있습니다. 지난 10 년간은 P2X 수용체가 ATP 13 바인딩하는 방법에 대한 우리의 이해의 증가를 목격하고 있지만 P2X 기능 조절에 보조 단백질의 역할은 덜 잘 이해 남아있다. 이 프로토콜에 설명된 접근 방식은 (첫 단계) C - 말단 세포와 상호 작용하는 단백질을 검사하여 P2X2 수용체에 의해 형성 신호 단지를 식별하도록 설계되었습니다. P2X2 수용체 신호 단지의 전체지도는 이러한 매혹적인 채널의 pathophysiology에 많이 필요한 통찰력을 제공할 것입니다.

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감사의 글

SW와 TMV는 국립 보건원에서 NCRR 및 NHLBI 지원합니다. BSK와 HS은 국립 보건원의 NINDS와 NIGMS에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세토니트릴시약JT Baker9829-02
아크릴아마이드시약Bio-Rad161-0156
암피실린시약VWR internationalVW1507-01
탄산수소암모늄시약Fluka09830
과황산암모늄 (APS)시약Sigma-AldrichA3678
아데노신 삼인산 (ATP)시약Sigma-AldrichA7699
브래드포드 시약시약Bio-Rad500-0006
브로모페놀 블루시약Fisher ScientificB-392
코마시 블루 R-250시약Santa Cruz Biotechnology, Inc.Sc-24972
디티오트레이톨 (DTT)시약EMD Millipore3860
에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)시약VWR internationalVW1474-01
에틸렌글리콜 tetraacetic acid (EGTA)시약Sigma-AldrichE8145
개미산시약EMD Millipore11670-1
Glutathione Sepharose 4B 비드시약GE Healthcare17-5132-01
염산 (HCl)시약Sigma-AldrichH1758
이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)시약Sigma-Aldrich15502
이오도아세트아미드시약Sigma-AldrichI1149
루리아-버타니(Luria-Bertani, LB) 배지시약EMD Millipore1.00547.5007
류펩틴시약Sigma-AldrichL8511
라이소자임시약Sigma-Aldrich62971
황산마그네슘 (MgSO4)4)시약Sigma-AldrichS7653
염화나트륨 (NaCl)시약Sigma-AldrichS3014
플루오린화 나트륨 (NaF)시약Sigma-AldrichS7920
오르토바나듐산 나트륨 (Na3음성 해설4)시약Sigma-AldrichS6508
Nonidet P40시약Fluka74385
페닐메탄설포닐플루오라이드 (PMSF)시약Sigma-AldrichP7626
프로테아제 억제제 정제시약Sigma-AldrichS8820
단백질 표준물질 시약Bio-Rad161-0305
사코실(Sarkosyl)시약Acros Organics61207
스크류 캡 바이알도구Agilent Technologies5182-0866
소듐 도데실 황산염시약Sigma-AldrichL4509
SYPRO® Ruby 단백질 겔 염색시약Bio-Rad170-3125
N,N,N’,N’-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)시약Sigma-AldrichT9281
Tris base시약Sigma-AldrichT1503
Triton X-100시약Sigma-AldrichT9284
트립신시약Promega Corp.V5111
Tween 20시약Sigma-AldrichP5927
물시약버딕(Burdick) &및 Jackson365-4
LTQ-Orbitrap 탠덤 질량 분석기도구Thermo Fisher Scientific, Inc.
나노 액체 크로마토그래피 시스템도구에크시전트(Eksigent)
B-Mercaptoethanol–에탄올시약Sigma-AldrichM6250
글리세롤EMD MilliporeGX0185-6

참고문헌

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  8. Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding. J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).
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