우리는 ATP - 문이 P2X2 수용체의 전체 길이 C 터미 너스에 바인딩 뇌 단백질을 식별하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 모든 P2X 수용체에 대한 확장 및이 방법의 체계적인 응용 프로그램은 P2X 수용체 신호의 더 나은 이해로 이어질 것으로 예상된다.
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이 논문에서
요약
초록
리간드 - 게이 티드 이온 채널은 신경계 1 시냅스 커뮤니케이 션을 기초. 포유 동물에서 리간드 - 문이 채널의 세 가족이 있습니다 cys 루프, 글루 탐 산염 - 게이 티드과 P2X 수용체 채널 2. 각각의 경우에 송신기의 바인딩은 이온들이 전기 그라디언트를 흘러이를 통해 기공의 개통에 이르게한다. 많은 리간드 - 문이 채널은 또한 하류 채널 개방 시간을 초과할 수 있습니다 역할 5 (예 : 유전자 규정)을 신호가 칼슘 이온 3, 4에 투과 수 있습니다. 따라서 리간드 - 문이 채널 몇 밀리초에서 일에 이르기까지 광범위한 시간 단위 이상의 신호 수 있습니다. 그것이 자신이 단백질에 의해 규제하는 방법 리간드 - 게이 티드 이온 채널을 이해하기 위해 필요하며, 어떻게 이러한 단백질이 중요한 역할을 감안할 때하면 신호를 조정할 수 있습니다. 최근 연구 많은 경우 전부는 아니 채널이 단백질 신호 단지 6 일부가 될 수있다하는 것이 좋습니다. 이 문서에서 우리는 P2X2 수용체 cytosolic 도메인의 C - 말단 부분에 바인딩 단백질을 식별하는 방법에 대해 설명합니다.
P2X 수용체는 ATP - 게이 티드 양이온 채널이 일곱 subunits (P2X1 - P2X7)로 이루어져 있습니다. P2X 수용체 널리들이 흥분성의 시냅스 전송 및 신경 전달 물질 릴리스 7 presynaptic 촉진을 중재 두뇌에 표현됩니다. P2X 수용체는 고르기가 아닌 고르기 세포에서 발견의 연결 신호, 염증과 심장 혈관 기능 8 키 역할을 중재하고 있습니다. P2X2 수용체는 신경계 9 풍부하고 본 연구의 초점입니다. 각 P2X의 subunit는 세포외 지역 7 세포내 N과 C 테르 (그림 1A) 7로 구분이 멤브레인 스패닝 세그먼트를 (TM1 & TM2) 소유로 생각됩니다. P2X의 subunits 10 (P2X1 - P2X7)는 아미노산 수준 11시 30~50% 시퀀스 상동을 보여줍니다. P2X 수용체가 ionotropic 수용체 중에서 가장 단순한 stoichiometry는 단지 세 subunits를 포함합니다. P2X2의 C - 말단 120 아미노산 (그림의 1B)로 구성되어 있으며, P2X2 수용체는 신호 단지의 일부가 될 수있는 가설을 지원하는 여러 단백질 도킹 합의 사이트가 포함됩니다. 몇 가지 기능이 P2X2 수용체 9 C - 말단에 기인하고 있지만 그러나, 연구는 분자 파트너 설명도 없어 그 전체 길이 C - 말단을 통해이 단백질의 세포 내쪽으로 몇 가지. 이 방법은 종이에 우리는 전체 길이 P2X2 수용체의 C - 말단과 상호 작용하는 단백질을 식별할 수있는 proteomic 방법을 설명합니다.
프로토콜
실험 절차
실험 절차 (그림 2) 아래 단계 현명한 방식으로 설명하는 네 부분으로 구성되어 있습니다.
1 부 : P2X2 수용체의 C - 말단의 Subcloning, 그리고 표현.
우리는 바인딩하는 뇌 단백질을 식별하는 전체 길이 박테리아 P2X2 수용체의 C - 말단을 표명했습니다.
- P2X2 수용체 (그림 1)의 C - 말단은 (잔류물 353-472) pGEX 4NT1 (GE 생명 과학)로 복제 및 시퀀싱과 검증, PCR에 의해 증폭되었다.
- 재조합 플라스미드가 E.으로 변화되었다 재조합 단백질의 표현에 대한 대장균 (BL21).
- 플라스미드 P2X2 CT - GST를 포함하는 박테리아 (E. 대장균 BL21)의 글리세롤 주식은 멸균 피펫 팁과 스크랩한 적합 선택적 마커 (50 G / ML 암피실린)와 함께 Luria - Bertani (LB) 미디어 5 ML에 주사했다 37C에서 궤도 통에 하룻밤 incubated.
- 600 nm의에서 광학 밀도가 도착할 때까지 밤새 재배 문화는 적절한 항생제 (50 μg / ML 암피....
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토론
이온 채널은 필수적인 멤브레인 단백질의 주요 클래스입니다. 그들은 선택적으로 플라즈마 막 걸쳐 자신의 전기 그라디언트 아래 이온의 움직임을 허용 물이 가득 모공이 포함되어 있습니다. 개방과 폐쇄 상태 사이의 이온 채널 게이트. 게이팅 단계 P2X의 리간드 게이 티드 이온 채널의 경우에는 송신기 (예 : ATP)에 의해 트리거됩니다, 또는 그것은 다른 단백질과 상호 작용에 의해 규제 수 있습니다. 지난 10 년간은 P2X 수용체가 ATP 13 바인딩하는 방법에 대한 우리의 이해의 증가를 목격하고 있지만 P2X 기능 조절에 보조 단백질의 역할은 덜 잘 이해 남아있다. 이 프로토콜에 설명된 접근 방식은 (첫 단계) C - 말단 세포와 상호 작용하는 단백질을 검사하여 P2X2 수용체에 의해 형성 신호 단지를 식별하도록 설계되었습니다. P2X2 수용체 신호 단지의 전체지도는 이러한 매혹적인 채널의 pathophysiology에 많이 필요한 통찰력을 제공할 것입니다.
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감사의 글
SW와 TMV는 국립 보건원에서 NCRR 및 NHLBI 지원합니다. BSK와 HS은 국립 보건원의 NINDS와 NIGMS에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 아세토니트릴 | 시약 | JT Baker | 9829-02 | |
| 아크릴아마이드 | 시약 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| 암피실린 | 시약 | VWR international | VW1507-01 | |
| 탄산수소암모늄 | 시약 | Fluka | 09830 | |
| 과황산암모늄 (APS) | 시약 | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 아데노신 삼인산 (ATP) | 시약 | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| 브래드포드 시약 | 시약 | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 브로모페놀 블루 | 시약 | Fisher Scientific | B-392 | |
| 코마시 블루 R-250 | 시약 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| 디티오트레이톨 (DTT) | 시약 | EMD Millipore | 3860 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) | 시약 | VWR international | VW1474-01 | |
| 에틸렌글리콜 tetraacetic acid (EGTA) | 시약 | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| 개미산 | 시약 | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B 비드 | 시약 | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| 염산 (HCl) | 시약 | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG) | 시약 | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| 이오도아세트아미드 | 시약 | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| 루리아-버타니(Luria-Bertani, LB) 배지 | 시약 | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| 류펩틴 | 시약 | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| 라이소자임 | 시약 | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| 황산마그네슘 (MgSO4)4) | 시약 | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 염화나트륨 (NaCl) | 시약 | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 플루오린화 나트륨 (NaF) | 시약 | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| 오르토바나듐산 나트륨 (Na3음성 해설4) | 시약 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | 시약 | Fluka | 74385 | |
| 페닐메탄설포닐플루오라이드 (PMSF) | 시약 | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| 프로테아제 억제제 정제 | 시약 | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 단백질 표준물질 | 시약 | Bio-Rad | 161-0305 | |
| 사코실(Sarkosyl) | 시약 | Acros Organics | 61207 | |
| 스크류 캡 바이알 | 도구 | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| 소듐 도데실 황산염 | 시약 | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Ruby 단백질 겔 염색 | 시약 | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED) | 시약 | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | 시약 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | 시약 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 트립신 | 시약 | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | 시약 | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| 물 | 시약 | 버딕(Burdick) &및 Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap 탠덤 질량 분석기 | 도구 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| 나노 액체 크로마토그래피 시스템 | 도구 | 에크시전트(Eksigent) | ||
| B-Mercaptoethanol–에탄올 | 시약 | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 글리세롤 | EMD Millipore | GX0185-6 |
참고문헌
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contr....
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