방법 논문

ES 세포 - 파생 Neuroepithelial 셀 문화

DOI:

10.3791/118

⸱

2006년 11월 30일

 ,  ,  , 
1McLean Hospital, Harvard Medical School

이 논문에서

요약

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stromal 세포 - 파생 유도 활동 (SDIA)를 사용하여 배아 줄기 (ES) 세포 neuroepithelial 엽 성의 전구 물질의 유도.

초록

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ES 세포들이 새로운 치료법의 개발을위한 매력적인 도구를 만들어 모든 세균 레이어에서 세포로 차별화할 가능성이있다. 일반적으로 ES 세포의 분화 먼저 다음 증식과 성숙 세포 phenotypes로 차별화된 수있는 미숙 전구 세포를 생성하는 개념을 따르고 있습니다. 첫째, 성숙한 신경 세포에 미숙 neuroepithelial 엽 성의 전구 물질 둘째, 그들의 분화의 유도 및 확장 : 이것은 또한 신경 세포의 개발은 두 가지 주요 단계를 다음과하는, ES 세포 - 파생 neurogenesis 적용됩니다. ES 세포로부터 신경 progenitors을 생산하는 일반적인 방법은 neuroectoderm 포함한 모든 세균 레이어에서 세포의 분화를 보여 embryoid 몸 (EB) 형성에 따라 달라집니다. neuroepithelial 셀 개발을 유도하기 위해 대안과 더 효율적인 방법은 두개골 골수 - 유래 stromal 세포 (1) 공동 culturing의 ES 세포에 의해 얻을 수 stromal 세포 - 파생 유도 활동 (SDIA)를 사용합니다. , EB 형성과 SDIA 둘 다 신경 유사 것으로 생각되고 있습니다 로제트 같은 구조의 개발, 튜브 및 / 또는 신경 능선과 같은 progenitors를 공개. 신경 엽 성의 전구 물질은 정의 문화 조건을 사용하여 특정 뉴런과 glia 세포로 확장하고 더욱 차별, 격리 수 있습니다. 여기, 우리는 stromal 세포 라인 MS5 (2-5)와 함께 공동 문화 실험에서 세대와 같은 rosettes의 절연을 설명합니다.

프로토콜

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1 단계

  1. 플레이트 mitomycin - C의 α - 멤 미디어 젤라틴 코팅 (30 분 0.01 %) 6 잘 접시에 70,000 / cm2의 밀도에 MS5 세포 (2.5 시간 10 μg / ML) ggrowth - 저해.
  2. 세포 부착과 monolayer를 (야간 성장 이상) 형성되면, SRM로 전환합니다.
  3. 수동으로 27과 주사기를 사용하여 ES 세포 배양 ½ G 바늘에서 ES 세포 식민지를 분리.
  4. MS5 전지 (6 자 판 당 보통 2-3 식민지)에 저밀도에서 1 ML 파란색 팁 및 플레이트와 함께 신중하게 식민지를 Tritrurate.

참고 : ES 세포도 collagenase 또는 트립신 효소를 사용하여 전파에서 촬영하실 수 있습니다.

2 단계

  1. 로제트 함유 식민지 양식까지 14~21일에 대한 MS5 모이통에서 ES 세포를 성장.


참고 : 변경 미디어 자주. rosettes은 식민지와 300-500 NG / ML 노긴는 SRM (3)에 추가하는 경우에는 자신의 형성이 크게 향상 될 수의 바깥 가장자리에 일반적으로있다. 차별 프로토콜에서는, SRM은 N2 - A 매체와 교환 수 있으며, 세포 사양 (2-5) 홍보 성장 또는 기타 요인과 함께 보충.

3 단계

  1. 격리하고 27로 rosettes을 선택 ½ G 바늘을 현미경.

참고 : 절단 및 MS5 stromal 세포를 채취하지 마십시오. 식민지가 rosettes 모여있다면, 어떤 사람은 전체 식민지를 분리하실 수 있습니다.


4 단계

  1. rosettes의 클러스터를 대기음, 폴리 - L - ornithine (0.001 %)과 fibronectin (1 μg / ML) 또는 laminin (1 μg / ML) 코팅 6 우물에 1 ML 파란색 팁 및 플레이트 그들과 함께 신중하게 tritrurate N2 - A 미디어는 일반적으로 bFGF (20 NG / ML)과 보완. rosettes는 개혁과 확장됩니다.

참고 : 셀 생존을 향상시키기 위해, 하나는 플레이트 방울의 작은 클러스터는 세포 밀도를 증가 수 있습니다. 이 단계는 또한 세포 사양 (2-5) 촉진 추가 성장이나 다른 요소와 N2 - 미디어를 보완하여 수정할 수 있습니다.

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토론

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이 프로토콜은 SDIA을 사용하여 인간의 ES 세포에서 neuroepithelial 세포를 생성 및 분리의 여러 단계를 보여줍니다. 이 방법의 응용 프로그램은 매니폴드이며 (예 : 1, 2, 5-9) 지정 뉴런을 생산하기 위해 많은 프로토콜에서 사용되고 있습니다. rosettes는 앞쪽에 표현형 (2, 5, 10)과 신경 튜브 세포를 닮은 또한 신경 크레스트 progenitors (11, 12)를 포함하는 것으로 생각되고 있습니다. 그들이 정의된 문화 환경에있는 특정 요인에 의해 패턴 될 수 있기 때문에 또한, 그들은 소성의 특정 수준을 유지합니다. 따라서 SDIA 파생 신경 progenitors 그들 ES 세포 분화의 패러다임에서 다른 신경 세포 인구의 유도를위한 유용한 도구 제작의 중심과 주변 신경 시스템에서 다양한 세포 유형으로 상승을 줄 수 있습니다.

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공개 사항

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저자들은 공개할 사항이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
L-GlutamineGIBCO, by Life Technologies25030
alpha-MEMGIBCO, by Life Technologies12571
Penicillin/streptomycinGIBCO, by Life Technologies15140
Knockout-DMEMGIBCO, by Life Technologies10829
Knockout serum replacementGIBCO, by Life Technologies10828
MEM nonessential amino acid solutionGIBCO, by Life Technologies12383
DMEM/F12GIBCO, by Life Technologies11330
N2-A supplementStem Cell Technologies07152
Mitomycin-CSigma-AldrichM0503
Gelatine type-ASigma-AldrichG1890
poly-L-ornithineSigma-AldrichP49570.01% 용액
LamininSigma-AldrichL-2020
FibronectinSigma-AldrichF2006
Basic fibroblast growth factor (bFGF)Invitrogen13256
27 1/2 G 바늘이 장착된 1 mL 주사기BD Biosciences309623
N2-A 배지배지DMEM/F12 + 1% N2-A supplement
혈청 대체 배지 (SRM)배지Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement + 1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine
α-MEM 배지배지α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin
MS5세포주기질 세포
현미경
6-웰 플레이트조직 배양용

참고문헌

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