Method Article

로블롤리 파인 PtGen2 cDNA Microarray 처리

DOI:

10.3791/1182

⸱

March 20th, 2009

 ,  ,  , 
1Warnell School of Forestry and Natural Resources, University of Georgia (UGA), 2Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica, Instituto Tecnologia Química e Biológica UNL, Av. da República

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cDNA microarray PtGen2은 로블롤리 파인의 유전자 발현 연구를 위해 개발되었습니다 P. taeda 기타 침엽수 종. 여기, 우리가 게재 사전 나은 일관성 감소 유물, 그리고 낮은 배경 수율이 배열을 함께 사용할 수있는 기술을 취급하고 세척 후 하이브 리다이 제이션.

Abstract

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PtGen2이 증폭 로블롤리 파인 에스트을 포함하는 26,496 기능 cDNA microarray입니다. 배열은 소나무와 다른 침엽수 종의 유전자 발현을 연구 연구자가 사용하는 우리 실험실에서 생산됩니다. PtGen2는 로블롤리 파인 우리의 유전자 발견 노력의 결과로 개발되었고, 주로 뿌리 조직에서 식별 시퀀스로 구성되어 있습니다,뿐만 아니라 바늘과 줄기에서. 1,2 PtGen2 서로 다른 레이블 싸이 염색 코니퍼 대상 cDNAs을 hybridizing하여 테스트되었습니다 모두 증폭이 아닌 증폭 간접 라벨링 방법을, 또한 하이브 리다이 제이션 및 세척 조건의 번호와 테스트 사용합니다. 이 비디오는 이전에 개발 절차에 일부 수정을 사용하여뿐만 하이브리드화 후로 사전 하이브리드화 전후 슬라이드의 취급 및 처리에 초점을 맞추고 있습니다. 3,4도 포함, 텍스트 형식에만 생성에 사용되는 프로토콜 있으며, 레이블 및 대상 cDNA s의 청소뿐만 아니라 소프트웨어에 대한 정보는 다운 스트림 데이터 처리에 사용.

PtGen2 완전히 제거하기 어려울 수 있습니다 소금의 높은 농도를 포함하는 독점 인쇄 버퍼와 함께 인쇄됩니다. 슬라이드는 미리 하이브리드화하기 전에 따뜻한 SDS 솔루션에 처음 세탁 있습니다. 사전 하이브리드화 후 슬라이드는 남은 염분의 제거를 완료하기 위해 물을 몇 가지 변경 사항 적극적으로 씻어 수 있습니다. LifterSlips ™는 다음 청소 및 슬라이드에 위치하고 cDNA로 분류하는 것은 신중 아르 슬라이드에 걸쳐 샘플에도 유통 제공하는 모세관 작용의 방법으로 microarray에로드하고, 거품 설립의 기회를 줄일 수있다. 배열에 목표의 하이브 리다이 제이션은 48 ° C에서 높은 습도 조건에서 이루어집니다. 하이브리드화 후, 표준 세척 일련의는 53에서 완료 ° C 및 확장 시간을위한 실내 온도. 이 기술을 이용하여 처리 PtGen2 슬라이드 소금을 줄이고 SDS - 파생 유물 자주 배열이 덜 엄격하게 처리되면 보았다. 여러 코니퍼 RNA 소스에서 파생된 목표를 Hybridizing이 처리 프로토콜 적은 유물 감소 배경을 굴복하고, 배열의 다른 실험 그룹 간의 더 나은 일관성을 제공했습니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(참고 제 1-4 비디오 시연되지 않음)

싸이 - 라벨 대상 cDNA 준비

어떤 다음은 우리가 hybridizations를 microarray하기 전에 로블롤리 파인 총 RNA 및 cDNA 간접 라벨에서 cDNA 합성을 위해 사용하는 프로토콜입니다. 몇 아닌 사소한 수정이되었습니다 있지만, 아래의 프로토콜 Invitrogen의 어깨 간접 cDNA 라벨링 키트와 함께 제공된 설명서에서 비슷합니다.

1 부 : 첫 번째 - 스트랜드 cDNA 합성 반응

  1. 믹스와 간단히 사용하기 전에 각각의 키트 구성 요소를 스핀.
  2. 다음과 같이 반응 준비 :
    • Xμl DEPC - H 2 O
    • Xμl 총 RNA 20 μg / 반응 (앰비온의 터보 DNase와 pretreated)
    • 2μl 닻을 Oligo (DT) 20 프리머 (2.5μg/μl)
    • 1μl 랜덤 Hexamer 프라이머
    • 총 볼륨 = 18μl
  3. 70 1-2분 위....

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PtGen2는 로블롤리 파인 연구 커뮤니티 주로 사용되도록 설계되었고 최근 개발, 사용자 정의 cDNA microarray입니다. 생성된 예비 결과는 지금까지 transcriptional 가뭄 스트레스에 대한 응답으로 발생하는 이벤트뿐만 아니라 해양 소나무, 피너스 피나 우리가 5,6의 배아 발달 동안 발생하는 모니터링 기능 변경 사항으로의 평가에 유용한 도구가 될 수있는 배열을 보였습니다 또한 최근 5 PtGen2와 같은 피너스 및 기타 침엽수 종의 유전자 발현을 연구 연구자에 의해 이용되고 잘 코니퍼 장군의 다양한 격리 대상 샘플을 사용하여 교차 종의 hybridizations에 PtGen2 작품.이 훈련 동영상 필요한 그들을 제공해야한다는 증명 기술 재단은 품질과 재현성 데이터를 생성합니다. 일반적으로 microarray 작업에 사용된 것보다 더 엄격한 하이브 리다이 제이션 및 세탁 프로토콜을 처리하면 우리 손에, PtGen2 더 나은 결과를 굴복. .......

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

라벨, 하이브리드화, 그리고 세척 프로토콜은 여기에 몇 가지 게놈 연구 (TIGR), 밴더빌트 Microarray 공유 리소스 (VMSR)에서 박사 숀 레비의 연구소에서 동시에 박사 J. 쿼큰부쉬에 의해 이전에 개발된들에게 수정하고, 박사를 포함 롭 알바 보이스 톰슨 연구소 (BTI) 코넬 대학교에서있는 동안.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
사전 혼성화 완충액액5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA
혼성화 완충액 완충액30% 포름아미드, 5X SSC, 5X 덴하르트 s, 1% PolyA RNA (인비트로겐, POLYA. GF), 0.1% SDS
세척 용액 #1버퍼1X SSC, 0.2% SDS, 43°로 예열; C
세척 용액 # 2: 완충액0.1X SSC, 0.2 % SDS
세척 용액 # 3: 완충액0.1X SSC
이소 프로필 알코올시약: Sigma-Aldrich34959-2.5L
50mL 원뿔형 튜브기타Falcon BD352070
15mL 원뿔형 튜브기타Falcon BD352196원심분리 중 각 50mL 원뿔형 튜브의 바닥에 놓인 이 캡 또는 유사한 캡을 사용하십시오
Coplin JarWheaton900520
염색 접시 및 원심분리 랙 기타Wheaton900200
알부민(BSA)기타Sigma-AldrichA-9418
PolyA RNAInvitrogenPOLYA.
SuperScriptTM 간접 cDNA 라벨링 키트InvitrogenL1014-02
터보 DNase키트AmbionAM1907
시스템
Cy-5 염료시약GE 헬스케어PA25001
리프터슬립™기타Erie Scientific25X601
HybChambers장비GeneMachinesJHYB200003
완충. 소 혈청의 GF Cy-3 염료 시약 GE 헬스케어 PA23001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
  2. Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
  3. Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dhar....

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