성인 zebrafish의 내이 (内耳) 감각 상피는 성인 척추 동물의 머리 세포 재생의 메커니즘을 이해하는 좋은 모델 시스템이다. 이 프로토콜은 우리가 휴대 전화와 subcellular 수준에서 재생 이벤트를 공부에 대한 조직 샘플을 얻을 수를 통해 상피 조직의 미세 절개를 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
내이 (内耳)에 Neurosensory 상피 조직은 청력과 균형 기능에 중요한 구조입니다. 따라서, 그것은 주로 세포의 두 가지 유형으로 구성되어있는 상피 조직의 세포 및 분자 기능을 이해하는 것이 중요합니다 : 세포 (HCs) 및 지원 전지 (SCS). 여기서 우리는 상피 구조가 고도로 공부 모든 척추 동물에 보존되어 있기 때문에 성인 zebrafish뿐만 아니라에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직을 연구하기 위해 선택할뿐만 아니라 성인 zebrafish는 HCs, 포유류는 출생 직후에 잃게하는 능력을 재생 할 수 있기 때문에. 우리는 HC 손실의 결과로 인간 심리 / 균형 적자의 임상 치료를 위해 도움이 될 수있는 성인 척추 동물의 내이 (内耳) HC 재생의 메커니즘을 연구하기위한 모델 시스템으로 성인 zebrafish의 내이 (内耳)를 사용합니다.
여기 우리는 성인 zebrafish에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 총 훌륭한 해부를하는 방법을 보여줍니다. 총 해부는 내이 (内耳)를 둘러싼 조직을 제거하고 우리가 감각 상피 조직의 세부 구조를 검사할 수있는 조직 섹션을 준비하는 데 도움이됩니다. 미세 절개은 개별 상피의 비 - 감각 상피 조직을 깨끗이 치우고 전체 마운트 상피 샘플에서 쉽게 전체 상피의 이질을 검토하는 데 있습니다.
프로토콜
1 부 : 조직의 준비
- 와 성인 zebrafish를 안락사 (에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate 소금, 0.03 %) MS - 222 버퍼.
- 물고기 목을 벨. 아래턱을 잘라 최대 복부 측면과 해부 패드에 머리를 장소, 곤충 핀으로 조직을 고정. 두개골에 복부 부드러운 조직을 제거하고 해부 현미경 하에서 미세 핀셋 한 쌍의와 두개골 캡슐의 복부 부분을 깨서.
- 4 ° C 하룻밤에 paraformaldehyde에서 생선 머리 (4 %) 이후의 수정 프로그램입니다.
- 3 번 5 분 때마다 (인산은 1X, 살린 버퍼) PBS에 고정 생선 머리를 씻어.
2 부 : 내이 (内耳)의 총 해부
- 복부 측면까지 함께 해부 패드에 생선 머리를 놓습니다. 곤충 핀으로 고정. 모든 다음 단계는 해부 현미경 하에서 실시하고 있습니다.
- 고급 핀셋 한 켤레와 내이 (内耳)를 통해 두개골 뼈를 제거하고 다음 조심스럽게 내이 (内耳)의 조직을 당겨 : saccules, lagenae 및 utricles 있습니다. saccule과 lagena가 긴밀하게 함께 서로 부착 때문에 철수하는 동안 utricle (saccule 및 la....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜에서는, 우리는 우리가 감각 상피 조직의 세포와 subcellular 기능을 공부에 대한 조직 샘플을 준비하는 수 성인 zebrafish의 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 매출과 미세 절개를 설명했다.
성공적인 해부, 매우 첫 번째 단계, 고정을 수행하기 위해서는 매우 중요합니다. 이전 솔루션은 절개 중에 처리하기 어려운 조직의 밑에 - 고정의 결과 때문에 항상 신선한 paraformaldehyde 솔루션을 사용할 수 있는지 확인합니다. 그러나, 그것은 절개 후 면역 / histological 얼룩의 결과에 영향을 것이기 때문에 당신이 너무 오래를위한 고정 솔루션에서 그들을 떠날하여 조직을 통해 - 수정하지 않은지 확인하십시오. 또한, 적절한 크기에 잘 유지 해부 도구를 사용하면 특히 미세 해부에 대한, 물론 중요합니다.
이 총 해부 프로토콜은 또한 조직을 특정 DNAs / RNAS / 단백질의 추출에 대한 내이 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
감사의 글
이 연구는 국가 인간 게놈 연구소, 건강의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | 시약 | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| PBS (인산완충식염수, 10X) | 시약 | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 파라포름알데히드 | 시약 | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Triton X-100 | 시약 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | 시약 | Invitrogen | A12379 | |
| DAPI가 포함된 VECTASHIELD Hard Set 봉입제 | 시약 | Vector Laboratories | H-1500 | |
| 해부 현미경 | 현미경 | Nikon 기기 | SMZ1000 | |
| 곤충 핀 | 도구 | Fine Science Tools | 26000-40 | |
| 가위 | 도구 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| 핀셋 | 도구 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045 | |
| 바늘형 칼날 | 도구 | 샤포인트 | 78-6810 | |
| 형광 현미경 | 현미경 | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 200M | |
| 해부 패드 | 도구 | eNasco | SB07840M | |
| 제브라피시 | 동물 | 다양한 | 입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주시기 바랍니다. |
재인쇄 및 허가
