이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 비디오에서는, 우리는 우리의 실험실은 개발 zebrafish의 두뇌 (구츠맨 외, 2008)를 구부, 접이식하는 데 필요한 세포 모양 변경 및 rearrangements을 분석하기 위해 개발한 방법을 보여줍니다. 이러한 분석은 척추 두뇌의 3D 구조의 개발에 필요한 기본 세포 생물학의 새로운 이해를 내실수하고, 크게 신경 튜브 morphogenesis를 공부하는 능력을 증가시킵니다. 배아 zebrafish 두뇌는 neuroepithelium가 급증 내에 심실로 18시간 포스트 수정 (HPF)에서 시작 모양이다. 24 HPF으로 신경 튜브 morphogenesis의 초기 단계를 완료합니다. 방법을 사용하면 여기에 설명 한 세포 단계에서 배아는 mRNA 인코딩 막 타겟 녹색 형광 단백질 (memGFP)로 주입됩니다. 주입과 부화, 배아, 18 사이의 24 HPF 후, 아가로 오스에 거꾸로, 장착하고 공촛점 현미경으로 몇 군데. 특히, zebrafish 배아는 형광 이미징을위한 이상적인 시스템을 만들어 투명합니다. 우리의 분석은 midbrain - hindbrain 경계와 hindbrain에 초점을 가지고 있지만,이 방법은 80-100 μm의 깊이에 zebrafish에서 지역의 분석을 위해 연장 수 있습니다.
프로토콜
1. 사출에 대한 mRNA 준비
- 이 절차에 사용되는 mRNA는 플라스미드 인코딩 CAAX - eGFP (memGFP) mRNA에서 베꼈는데 있습니다. 먼저 플라스미드는 구츠맨 외, 2008에 따라 linearize.
- 다음 mMessage mMachine 키트를 사용 memGFP mRNA를 고쳐 쓰다.
- -80에서 결과 1μg/μl으로 mRNA, 나누어지는 및 상점을 희석 ° C.
- 한 세포 단계에서 배아 차선의 넓이와 1퍼센트 아가로 오스의 사출 금형을 준비합니다.
- 주사 전날에, 여성에서 남성을 분리 교배 새장을 설정합니다.
- 주사 당일, 주사를 준비하는 micropipette의 풀러를 사용하여 모세 바늘을 가져옵니다.
2. mRNA를 주입
- 주사 당일, 얼음 1μg/μl의 memGFP의 mRNA의 나누어지는를 녹여.
- 200ng/μl의 최종 농도로 물에 mRNA 1:5 희석, 얼음 계속.
- 200ng/μl에서 준비 memGFP의 mRNA의 1μl와 모세관 바늘을로드합니다.
- 장소는 가스 공급 microinjector에 연결된 micromanipulator에 바....
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토론
이 비디오에서는, 우리는 단세포 zebrafish의 배아에 mRNA 분사하는 방법을 보여줍니다. 여기서는 각 셀에 레이블을 막 타겟 GFP를 인코딩 mRNA를 사용합니다. 그러면 단일 셀 해상도에서 개발 두뇌를 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 midbrain - hindbrain 경계의 형성 (구츠맨 외, 2008)에 필요한 세포 모양의 변화의 소설 유형, 기초 수축을 공부하고있었습니다. 다른 현상과 마찬가지로 분석을 크게 척추 morphogenesis 및 기본 세포 생물학에 대한 우리의 이해를 확장 가능성이있다.
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감사의 글
처음 Sive 연구실에서이 기술을 개발 박사 제니퍼 구츠맨 많은 감사드립니다. 친절 플라스미드 인코딩 CAAX - GFP의 mRNA를 제공 데이나 파버 암 연구소 - 보스턴, MA에서도 JB 그린 감사합니다. 공촛점 이미지는 화이트 헤드의 WM 켁 재단 생물 이미징 시설에서 실시되었다. HS는 NIHMH70926에 의해 지원됩니다. EG는 NSF 미리 박사 친교에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | 시약 | Lonza Inc. | 50027 | |
| 3-아미노벤조산 에틸 에스테르 (Tricaine) | 시약 | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| 모세관 튜브 | 도구 | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 외경 1.0mm x 내경 0.5mm/섬유 100mm |
| 실리콘 진공 그리스 | 시약 | VWR international | W0S717 | |
| 포셉 | 도구 | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μ피펫 팁 | 도구 | USA Scientific, Inc. | 111-0806 | 이 크기는 수정 후 24시간(24 hpf) 된 배아에 적합한 크기입니다. |
| mMessage mMachine 전사 키트 | 시약 | Ambion | AM1340 | SP6 RNA 중합효소 |
| Zeiss LSM 510 스캐닝 공초점 현미경 | 현미경 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 마이크로매니퓰레이터 | 도구 | Narishige International | ||
| 마이크로인젝터 | 도구 | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 마이크로피펫 풀러 | 도구 | Sutter Instrument Co. |
참고문헌
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laborat....
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