교미 및 tetrad 분리는 유전자 분석을 위해 필요합니다 Chlamydomonas reinhardtii. 여기 gametogenesis, 짝짓기, 접합자 발아 및 tetrad의 해부에 대한 표준 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 덜 익숙한 과학자 유전 방식을받을 수있는 것입 단계의 쉬운 따라 시리즈로 구성되어 있습니다 Chlamydomonas.
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이 논문에서
요약
프로토콜
1 부 : gametogenesis에 대한 종자의 준비
참고 : 모든 조작은 실온에서 실시한다. 높거나 낮은 온도는 발아 접합자의 속도에 영향을 미칠 것이며, 부정적인 생존에 영향을 줄 수 있습니다.
중요한 고려 사항 : 성관계를 할 수있는 변종이 견고하게 성장 및 곰팡이 또는 세균 오염 무료입니다하는 필수 좋습니다. 변종은 정기적으로 전송되지 않은 경우, 풍부한 매체에 통로 gametes의 생성을 선행해야합니다.
- 성관계를하는 종자는 TAP 판 (100 × 15 ㎜), 플레이트 당 1-2 종자로 전송됩니다. 세포는 가로 1cm에 대해 집중적으로 스트립에서 성장한다.
- 견고하게 성장하는 세포의 두꺼운 층이 존재 때까지 탭 접시에 부화는 중간 전송 필요한 경우와 계속해야합니다. 일반 사용 야생 형 변종은 며칠없이 구절에만 걸릴 수 있습니다 반면 최근 passaged되지 않은 변종이 한 구절 1 주일 총 필요할 수 있습니다. 광 구분 돌연변이 추가 시간이 필요할 수 있습니다.
- 질소에 대한 결함되며 gametogenesis를 유도하기 위해 시작합니다 N10 플레이트에 TAP 플레이트의 모든 세포를 전송합니다. 그들은 TAP 판에 존재했다만큼, 두꺼운 슬래브로 세포를 전송합니다. 이것은 세포의 후속 수집을 용이하게합니다. N10 3 일 후에, 세포는 gametogenesis를 받아야 준비가되어 있습니다. 세포 분열이 N10에서 속도가 느린 것입니다, 그러나 전지는 진한 녹색 유지됩니다. 가능한 zygotes를 얻을 수 없습니다와 같은 오염 종자는 폐기해야합니다.
2 부 : 번식
- 각 변형이 50 ML erlenmeyer 플라스크에 전송하고 약 2.5 ML 멸균 증류수에 resuspended 있습니다. 이 중 와이어 루프 또는 살균 막대를 사용하여 할 수 있으며, 중요한 것은 세포가 잘 대단히 짧은 시간에 중단이 아니라는 점이다. 물의 정확한 볼륨으로 눈으로 gauged 세포 농도가, 각 변형에 대한에 대한 동일하도록 조정해야합니다.
- 셀 2 시간 동안 강한 조명 (1.260 μ의 E / m 2 / 초) 아래의 동요, 세포가 운동성이있는 gametes 될 것이다 어떤 시간 동안입니다. 운동성은 가벼운 현미경으로 확인하여야한다. gametes이 저조한 수영 경우, 비효율적인 짝짓기가 될 가능성이 높습니다. 그러나, 심지어 제대로 운동성이있는 계통이 감소 주파수를 짝짓기합니다.
- 의 다음 동일한 볼륨 마운트 + 및 MT - gametes는 단일 50 ML 플라스크에 결합됩니다. Gametes는 교반없이 강한 조명 (1.260 μ의 E / m 2 / 초) 아래에 남아 있습니다.
- 짝짓기는 빛을 현미경으로 바로 확인하실 수 있습니다. gametes의 쌍 신속하게 형성하고, 빠르게 움직이는 세포 flagella에 참가으로 표시됩니다. 짝짓기가 매우 빠른 것으로 나타나는 경우, 샘플은 zygotes의 생성을 위해 30 분 -1 시간 이내에 촬영한한다. 그렇지 않다면이 옵션이지만, 짝짓기는 각 시간을 확인하실 수 있습니다. zygotes의 최적 밀도를주는 시간이 십자가 사이에 크게 달라질 수 있기 때문에 1 시간, 2 시간, 3 시간 및 4 시간 후에 gametes 예를 결합 후 다른 시간에 짝짓기 혼합물의 aliquots을하는 것이 좋습니다. 접시마다 3-4 곳, 이것은 300 μL 시료에 TAP - 3% Difco 한천 60 × 15mm 플레이트를 전송하여 수행됩니다. 이 짝짓기 쌍을 방해 수 있으므로 짝짓기 혼합물을 선동하지 않도록주의하십시오. 그것이 낮은 가격에 아거스 미만의 오염 물질을 가지고 있으며, 그것은 현미경으로 zygotes을 볼 쉽게되므로 Difco 한천이 사용됩니다.
사용하지 않는 짝짓기 혼합물은 하룻밤 사이에 술병에 남아있을 수 있으며, 짝짓기 반응의 품질은 다음날 분명한 것입니다. 짝짓기가 효율적인 경우 zygotes은 술병의 벽이나 바닥을 준수하고, 매체는 명확 나타납니다. 플라스크의도 동요가 zygotes을 이동시키다되지 않습니다. 혼합물이 합리적인 활기와 흥분되는 유리에 아무것도 스틱은 다음 교미 비효율적 않았거나 자리를 대신하지 않은 경우. - 어떤 표면 액체가 흡수되기 전에 짝짓기 혼합물을 포함하는 TAP - Difco 접시는 열려 뚜껑과 살균 모자 건조됩니다. 접합 포자 성숙은 어둠 속에서 자리를 취할 것입니다 때문에 접시는 일반적으로 다음 호일에 싸서 18 시간 동안 조명 (700 NE / m 2 / 초)에 남아 있습니다. 변종은 시간과 날짜를 짝짓기 것은 접시와 호일 모두에 기록됩니다, 교차. 접합자 발아 효율이 점차 감소하지만 접시는 5~7일 저장되며 더 이상 보관하실 수 있습니다.
파트 3 : Tetrad 해부
- 식물 세포는 같은 메스로 무딘 칼날을 사용하여 짝짓기 혼합물의 건조 명소를 긁어 냈해야합니다. 블레이드는 3 % 한천을 밀접하게 버티자 zygotes의 영역을 노출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 단계는 일반적으로 zygotes가 다음날 아침으로 germinated있다 있도록, 오후에 이루어집니다,하지만 두 번째, 식물 부문 공사를하지 않은8 자손을 얻을 수 있습니다. Chlamydomonas의 생물학 자들이 신속하게 그들은 식물 세포보다 큰, 그리고 검은 윤곽을 제공하는 두꺼운 접합 포자 벽 기능이 있기 때문에, 현미경 zygotes를 인식할 수 배웁니다. Zygospores는 종종 노란색 표시뿐만 아니라, 다소 녹색 수 있습니다. 식물 세포가 쉽게 옆으로 이동하는 동안 가장 중요한 캐릭터들이 한천에 충실한다는 것입니다. 그러나, 접시면하는 것은 지나치게이 경우되지 않습니다 건조됩니다. 또한, 짝짓기 혼합물이 너무 밀도 있었다면, zygotes 개인 zygotes의 전송이 어렵거나 불가능한 것입니다 매트를 형성 수 있습니다. 적절한 밀도는 2.1 단계에 설립하고, 신속하게 경험을 배울 것입니다.
- 유리 바늘은 zygotes를 수집하고 tetrad 자손 분리를위한 준비가되어 있습니다. 이들은 부러 수있는 긴 얇은 스레드를 생성하는 작은 불꽃에 3mm 유리 막대를 당겨 준비가되어 있습니다. 이러한 테이퍼 엔드 팁이 낮은 화염 (예 : 알코올이나 불타는 일치)에서 간단한 가열하여 고리에 smoothed 또는 구부 수 있습니다. 그들은 상당히 쉽게 휴식 이후 특히 경험이 사용자를 위해, 3 개 이상의 유리 바늘을 준비합니다.
- Zygotes는 작은 말뚝에 유리 바늘을 사용하여 3% TAP - Difco 플레이트에 모여 있습니다. zygotes을 포함 한천의 광장 (최대 0.5 cm 2) 형성과 무딘 메스를 사용하여 excised 수 있습니다. 그런 다음, 한천 블록은 15mm 1.5 % TAP - Difco 플레이트에 얼굴을 아래로 배치하고, zygotes를 배포, 접시 상단에서 1.5 cm에 대한 수평선을 따라 미끄러졌습니다. 최고 수평선, 그리고 약 1.5 cm 가로 0.5 cm 수직 간격 격자는 접시의 뒷면에 새겨져 있습니다. 그리드는 tetrad 자손 (격자 또한 절개의 하루 에칭 수있는)을 분리를위한 가이드로 다음날 사용됩니다. 마지막으로, 개별 zygotes는 판 당 20-30에 대한 zygotes와 함께, 각 수직선과 상단 수평 라인의 교차로로 이동합니다. 겨우 12 정도가를 해부한다, 모든 접합자는 germinates 아니라, 일부가 파열되기 전에 두 번 분할되지만, 이렇게 여분 zygotes이 필요합니다.
- 배포 후 실수로 3 % 한천 플레이트에서 전송되었습니다 zygotes, 그리고 식물 세포는 클로로포름의 얇은 (1~2밀리미터) 레이어를 포함하는 유리 접시 이상 30 초 동안 거꾸로 번호판을 노출에 의해 살해됩니다. 접시와 클로로포름 사이의 거리는 약 5cm해야합니다. 너무 클로로포름을 사용하는 경우 거리가 너무 작거나 큰 경우, 또는 한 위험이 중 zygotes를 죽이고, 또는 식물 세포를 죽일 수 없습니다. zygospores가 선택성을 보장하기 위해, 발아 판을 배포했습니다 후 클로로포름 치료가 즉시 이루어져야합니다.
- 발아는 대부분의 종자에 대한 16-20시간이 걸리지만 유전자형과 zygotes의 나이가 달라집니다. 발아 들어, 접시는 낮은 조명 (239 NE / m 2 / 초) 아래에 배치, 또는 매체에 비추어 휴지로 접시를 덮고으로 흐리게.
- Germinated zygotes는 그들 내부의 딸 세포로 부어하거나 때로는 파열 세포로 현미경으로 확인할 수 있습니다. 접합 포자가 파열되지 않은 경우 발아가 발생한다면, 부드럽게 유리 바늘로 감동하면 벽을 깰 것이다. 딸 세포가 부드럽게 접합자 아래의 격자 점에 끌려 있습니다. 유리 바늘의 압력에 의해 한천에서 발표 액체 매체의 소량의 세포를 캡처하고, 바늘 뒤에이 "웅덩이"를 드래그하여이 작업을 수행하는 가장 쉬운 그것을 것입니다. 하나는 접합자가 아닌 두 번 나누어 가지고 식물 세포를 해부했다는 "보험"의 한 형태로 그 간격 네 개의 딸 세포에서이며, 접합 포자 벽의 "스킨"은 유지됩니다.
- 보이는 clonies가 후속 분석을 위해 선택한 수있을 때까지 해부 자손은 적절한 조건 하에서 재배하고 있습니다. 플레이트는 오염에 대해 매일 모니터링해야합니다.
참고 : 식물 diploids의 생성이 여기에 적용하지만, 기본적으로 두 부모 변형의 성장을 지원하지 않습니다 매체에 짝짓기 혼합 도금 포함하지만, diploid의 성장 (예 : 두 개의 서로 다른 auxotropic 마커)을 지원하지 않습니다이다. 접시는 zygotes의 형성을 피하기 위해 빛을에 보관됩니다.
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토론
유전자 분석 Chlamydomonas에서 간단하지만, 그것은 특정 기술이 gametes와 별도 tetrad의 자손을 생성해야합니다. 건강 변종과 함께, 기술은 쉽게 찾았습니다. 일부 돌연변이 변종으로, 그것은 예술의 더되고, 독자들은 역사 노트와 실용적인 힌트에 대한 최근 출판 Chlamydomonas의 Sourcebook의 볼륨 1을 참조해야합니다. 또한, 그것은 기본적인 테마에 많은 변화 접합자 유통 및 해부의 패턴, 유도 gametogenesis하는 방법에 이르기까지, 위에서 설명한이있다는 것을 지적해야합니다. 궁극적으로, 각 연구자들은 편안 지대를 발견하거나, 실험실 특정 프로토콜에 적응.
위에서 설명한 특정 기술적인 정보는 되풀이해야합니다. 특히, 세포가 건강하고 감염없이해야합니다. 이곳은 오랜 기간 동안 교차되지 않은 변종이 잘되지 않을 수 있습니다 메이트 연구소 - 적응하고, 수질도 gametogenesis에 영향을 미칠 수있는 것...
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공개 사항
저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.
감사의 글
이 프로토콜은 인스티투트 드 Biologie Physico - Chimique, 파리, 프랑스의 프란시스 - 엉드헤 Wollman의 실험실에서 배운 기술을 기반으로합니다. 저자는 원래 Chlamydomonas 유전자 기술에 DBS를 도입 재클린 지라 - Bascou에 분께. 저자 실험실에서 Chlamydomonas 연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 상을 MCB - 0646350에서 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| CC-125 | 교배형 plus 균주 | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | 교배형 minus 균주 | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | 배양 배지 | |||
| N10 | 배양 배지 | |||
| Difco agar | 시약 | |||
| Fisherbrand 스테인리스강 블레이드 | 도구 | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD 외과용 블레이드 핸들 | 도구 | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand 금속 메스 | 도구 | Fisher Scientific | 08-920A |
참고문헌
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
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재인쇄 및 허가
