신경 세포와 Glia 개발 연구 랫 두뇌 집계 문화의 준비

요약

배아 쥐의 두뇌 집합의 문화 시스템을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 집계에 Multipotent progenitors 개발하고 뉴런, astrocytes 및 oligodendrocytes로 구별하실 수 있습니다.

초록

중추 신경계의 성숙 뉴런과 glia (CNS)에 progenitors의 recapitulates 개발과 차별화는 axo - glial 상호 작용, 속성과 multipotent progenitors의 분화, 그리고 oligodendroglial의 진행을 조사 neuroscientists위한 강력한 플랫폼을 제공하는 것이 체외 시스템 세포 및 분자 수준에서 세포 혈통. 우리는 여기 3~4주에 혈청이없는 배지에서 유지 수 있으며, 신경 세포 - glia 상호 작용과 CNS의 myelination을 연구하는 모델로 저희 연구실에서 사용되는 배아의 쥐 forebrains에서 CNS의 집계 문화 시스템을 설명합니다. 이 비디오 클립은 E16 쥐의 두뇌에서 이러한 CNS의 집계 문화를 분리하고 성장하는 방법을 보여줍니다. 또한, 동일한 뇌 해부에서 매우 풍부한 정기 dissociated의 연결을 문화가 쉽게 얻을 수 있으며, 다양한 연구에 사용 CNS의 뉴런 또는 다른 세포 공동 배양에 사용.

프로토콜

절개 전에 준비

수술 도구 : 압력솥의 모든 해부 가위와 집게를 소독

Coverslip 청소 :

1. 최소 24 H에 대한 33% HCL에 1L 잔디 비커의 모든 coverslips을 (24 잘 접시 직경 15mm) 소크
2. 모든 잔류 HCL을 제거 가끔 흔들어 10 분 물을 실행하는 와시
3. Millipore 물로 헹굼
4. 물을 배수하다
5. 95~98% 에탄올에 coverslips 소크
6. 플랫 플레이트와 공기의 깨끗한 조직 전송 coverslips은 coverslips을 건조
7. 알루미늄 호일과 압력솥와 커버, 유리 비커에 coverslips을 전송
   참고 : Coverslips이 단계에서 저장할 수 있습니다
8. 문화 접시에 개인 coverslip를 놓습니다. 코팅 준비

Coverslip 코팅 :

1. PBS 및 필터 - 소독 (0.22 μm의)와 폴리 - D - 라이신 100 X 주식 (PDL, -20 ° C에서 aliquots로 저장 PBS에서 알부민 0.5 % 소 혈청에서 10 MG / ML을) 희석
2. 37 2 H 1 X PDL 솔루션 (~ 0.15 ML / cm ²⁾ · 인큐베이터에서 C와 외투 coverslips
3. PDL 솔루션을 제거하고 완전히 멸균 ddH ₂ O 건조 coverslips 3 번 씻어

참고 : coverslips / 각 해부에 대한 번호판 충분한 문장. PDL - 코팅 coverslips 4에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다 ° C.

미디어 솔루션

해부 매체 (DM)는 10 MM의 HEPES (Invitrogen 15,630)과 보충 (HBSS, Invitrogen 14175) 무균 얼음 차가운 행크의 밸런스드 소금 솔루션 (W ​​/ O 칼슘 ^{2 +,} MG ^{2 +)를} 사용합니다.

누계 문화 미디어 : 2% B27, 1 X 사토, 0.5 MM 나트륨 pyruvate, 0.75mM GlutaMAX, 60μg/ml N - acetylcysteine, 5 μg / ML : DMEM/NBB27 매체 DMEM / Neurobasal를 (권 1시 1분 권)를 포함 인슐린, 10nM D - 비오틴, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신. 집계 문화 매체의 100 ML하려면 50 ML DMEM (W / O pyruvate / 글루타민, Invitrogen 11,960) 50 ML Neurobasal 매체 (Invitrogen 211034), 375 μl GlutaMax (100 X, Invitrogen 35,050), 5.5 MG 나트륨 pyruvate를 섞어 (시그마 P2256), 2 ML B27 (Invitrogen 17,504)는, 6.3 MG N - acetylcysteine​​ (시그마 A8199), 사토 주식 1 ML, D - 비오틴 주식 (4000 X 주식 40 25 μl를 (100 X 주식은 아래 참조) PBS에서 μm의는 -20에서 aliquots ° C. 시그마 B4639), 인슐린 100 μl (1000 X 주식, -20에서 aliquots로 저장 0.01N HCL 5 MG / ML ° C, 시그마 16,634), 1 ML 페니실린로 저장 / 스트렙토 마이신 (100 X 주식, Invitrogen 15140)은, 필터 소독 및 저장 4 ° C.

사토 100 X 주식 솔루션 : 주식의 40 ML을하려면 다음과 같이 혼합 400가, 400 밀리그램의 BSA (시그마 A9647), progesterone 10 μl (25 MG / ML 에탄올은 같은 MG APO - 트랜스페린 (시그마 T2252) 저장된 40 ML의 Neurobasal -20에서 aliquots ° C. 시그마 P8783), 64 MG putrescine (시그마 P7505), 그리고 나트륨 selenite (-20에서 aliquots로 저장 PBS에서 30 μm의, ° C, 시그마 S5​​261) 40 μl. -20 ° C.에 aliquots로 사토 재고 솔루션, 그리고 상점을 소독 필터

신경 도금 매체 (PM) : Neurobasal 매체, 2퍼센트 B27, 2mM 글루타민 (100x 주식, -20 ° C, Invitrogen 25,030에 저장된 aliquots), 25μM 글루탐산 (100 주식, -20 ° C에 저장된 aliquots), 1 % 페니실린은 / 스트렙토 마이신.

신경 세포의 문화 매체 (CM) : Neurobasal 매체, 2퍼센트 B27, 2mM 글루타민 (100x 주식, -20 ° C에 저장된 aliquots), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신.

5 FdU 주식 : Neurobasal 매체 100x 재고, 1mM 5 - 플루오로 - 2' - deoxyuridine (시그마 F0503) and1mM 유리딘 (시그마 U3003). 필터 -20 ° C.에 살균 및 aliquots로 저장

Papain의 소화 솔루션 (이전 해부 신선한 확인) :

1. 4ml DM의 3.2 MG L - 시스테인 (시그마 C - 7352)를 디졸브
2. 37 1N NaOH (산도 검사 스트립에서 테스트)와 물을 욕조에 장소 주변 7.4으로 산도를 조절 ° C
   참고 : 오른쪽 조직 소화하기 전에 다음 단계를 (아래 참조) 수행합니다.
3. 20 단위 / ML의 최종 농도 papain 추가
4. (0.22mm) 소독 필터, 그리고 37 물 목욕에서 개최 ° C

트립신 억제제 솔루션 (이전 해부 신선한 확인) :

1. 20ml DM 0.2 g 트립신 억제제 (시그마 T7295)를 디졸브
2. 산도를 확인하고 1 N NaOH로 ~ 7.4으로 산도를 조절
3. 소독 필터, 그리고 37 물 목욕에서 개최 ° C

뇌 해부

설정 :

• 소독 집게와 가위
• 70 % 에탄올
• 클린 조직 종이와 diap벤치에 어 패드
• 벤치에서 자궁과 태아를위한 얼음처럼 차가운 DM과​​ 10cm의 페트리 요리
• 해부 현미경에서 얼음 플랫폼
• 얼음 DM과 2-3 6cm 요리
• 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 PM

1. 임신 스프 라그 - 돌리 귀하의 기관 애니멀 케어의 승인 절차에 따라 쥐 (E16) 우리위원회 (IACUC)를 안락사
2. 복부에 기저귀 패드와 ...의 난소를 제거하다 알코올에 쥐하다
3. V 모양의 절개는 피부를 절단하기 위해 복부 피부와 가위를 잡아 핀셋을 사용하여
4. 피부를 따로 확산과 근육 계층을 통해자를 다른 소독 핀셋과 가위를 사용
5. 배아 주머 니나의 사슬을 추출하고 얼음처럼 차가운 DM을 포함 10cm 접시에 그들을 전송
6. microdissection 가위를 사용하면, 신중하게 각각의 배아에서 색 및 뇌 각 배아를 제거하고, 장소는 얼음 플랫폼에 DM과 함께 깨끗한 10cm 접시에 두뇌를 해방
7. 판상 후드와 해부 현미경 아래 midbrain / hindbrain 섹션을 제거하고 meninges를 제​​거하는 미세 집게를 사용하여 얼음 팩 DM으로 새 6cm 접시에 청소 cortices / 해마를 전송
   참고 :이 단계에서, 조직은 효소 분해를위한 준비가되었습니다.
8. papain과 트립신 억제제 솔루션과 필터 소독 만들기
9. cortices에서 DM 초과 / hippocampi을 제거
10. 준비 papain의 소화 솔루션의 4ml 추가
11. 50ml 튜브에 모든 내용을 전송 37에서 물을 욕조에 팔콘 튜브를 삽입 ° C 정확히 5 분
12. 피펫과 papain 솔루션을 제거
13. 2-3 분 5ml 트립신 억제제 솔루션, 소용돌이 관, 37에서 물이 욕조에서 개최 ° C 추가
14. 트립신 억제제 솔루션을 제거
15. 단계 13 14 세 번 반복
16. 20ml 따뜻한 PM 추가
17. 모든 대단히 짧은 시간이 (~ 20-30 회)까지 사라졌습니다 씹다
18. 7min에 대한 100xg에서 원심 분리기
19. 10ml PM의 펠렛을 Resuspend 및 원심 분리에 의해 두 번 씻어
20. 일반적인 신경 세포 배양 또는 총체적 문화 NBB27/DMEM에 10ml PM에 펠릿을 Resuspend
21. 70μm 셀 sieves 통해 세포 패스
22. 라이브 세포를 카운트
23. 일반적인 신경 세포 배양을위한 세포를 아래에 설명된이나 접시 등 총체적 문화로 이동
    참고 :이 단계에서 매우 풍부한 신경 세포 배양은 실험 목적에 따라 ² 200-640 셀 / mm의 밀도에서 PDL - 코팅 접시에 dissociated 세포를 도금하여 얻을 수 있습니다. 세포 (~ 2 4h) 첨부 후, 따뜻한 PM과 매체를 바꿉니다. 일 4 시간 연장 기간에 대해 culturing 경우, 따뜻한 CM과 함께 매체의 절반을 교체하십시오. 고도의 연결을 문화, mitotic 억제제를 정화를위한 5 FdU (최종 농도 10 μm의)이 (DIV2 - 3 동안 즉,) 비의 연결을 세포 증식을 억제하기 위해 DIV2에 추가할 수 있습니다. 2 일 CM에서 복구 후에, 세포는 맥박이 완전한 매체 변경 다음 다른 이일 (DIV 6-7) 5 - FdU로 다시 처리됩니다. 그 이후, 신선한, 따뜻한 CM 모든 3~4일과 매체의 절반을 교체하십시오. 최대 4 주 동안 뉴런이 가능한 있습니다.

합산 준비와 도금

1. 2x10 ⁶ 셀 / ML의 밀도에 1X 사토 10ng/ml CNTF 및 10μM forskolin을 포함 NBB27/DMEM 매체에 dissociated 세포를 일시 중지
2. uncoated 6 잘 플레이트의 각 우물에 세포 현탁액의 2ml을 전송
3. 3 박에 대한 문화. 매일, 부드럽게 한번 P1000 Pipetman를 사용하여 셀을 resuspend
   참고 : 세포 집합체 (그림 1)을 형성 시작합니다.
4. 집계 도금 전날에 코팅 플레이트 / Matrigel과 coverslips :
   • 주식 Matrigel (성장 인자는 감소, BD Biosciences 354230) 얼음 추위 DMEM과 1시 20분을 희석
     참고 : Matrigel의 aliquots가 제조 업체 절차에 따라 작성되어야합니다. 모든 팁, Eppendorf 튜브 및 재고 aliquots을 만들기위한 솔루션 Matrigel 중합을 피하기 위해 추운해야합니다. Matrigel의 Aliquots는 -80 ° C에서 보관 및 4 ° C.에 해동 아르
   • 37 ° C 배양기에서 하룻밤 희석 Matrigel 솔루션의 300μl/well와 코트는 이전 PDL - 코팅 coverslips
   • 따뜻한 PBS로 세척 후 살균 따뜻한 ddH ₂ O와 접시를 세척하고 인큐베이터에있는 접시를 두십시오.
5. 골재 형성 후 3 일, 부드럽게 50ml 팔콘 튜브에 200μm 메쉬를 통해 중지를 다시 세포를 resuspend 및 체. 집계 중력 (~ 3 - 5 분​​)에 의해 튜브의 바닥에 정착하도록 허용
6. 조심스럽게 뜨는을 제거
7. 미디어를 추가 부드럽게 집계를 resuspend하고 다시 쉬라 구. 죽은 세포, 개별 세포와 찌꺼기를 제거하려면이 절차를 여러 번 반복합니다. 뜨는 아직 집계되지 않은 세포와 debri를 포함 여부를 확인하도록 현미경을 사용하여에스
8. 부드럽게 같은 NBB27/DMEM 매체에서 집계 (그림 1) resuspend 및 집계 계산
9. 25-30 주위 aggreggats/50ul로 집계의 밀도를 조절
10. 도금에 대한 2ml Eppendorf 튜브에 집계 정지 전송 aliquots (500 1000μl)
    참고 : 집합체가 튜브의 바닥에 정착하는 경향이 있기 때문에 그것이 도금에 대한 총체적 정학의 여러 튜브를 만들기 위해 매우 중요합니다. 부드럽게 자주 각 coverslip에 도금 집계 비슷한 번호를 보장하기 위해 코팅 coverslips 또는 문화 접시에 그들을 심는 전에 집계를 resuspend.
11. 인큐베이터에서 Matrigel - 코팅 coverslips을 포함하고있는 문화 판을 가져가라. 각 우물에서 솔루션을 제거, 따뜻한 PBS 및 ddH ₂ O와 coverslips을 씻어 후 건조 짧게. 그들은 골재 시딩을 위해 지금 준비가되어
12. 그들이 시딩 전에 균일하게 배포할 수 있도록 집계 중지를 포함한 튜브를 반전. 각 coverslip의 중심에 집계 정지 50μl를로드하고, 부드럽게 집계는 coverslip에 균일하게 연결할 수 있도록 더 이상 방해하지 않고 인큐베이터에 다시 접시를 넣어
    참고 : 집합체의 밀도는 매우 중요합니다. 집합체가 씨앗을 품고있다면 너무 서로 가까이에 또는 시딩 밀도가 높은 경우, 그들의 성장으로 함께 병합하는 경향이있다.
13. 나중에 또는 이른 다음날 아침마다 잘 4-6 H에 추가 DMEM/NBB27medium (500 μl)를 추가
14. 집계 문화를 유지하려면, 반은 모든 3~4일 매체를 변경합니다. 매체를 변경하면, 집계를 방해하지 않도록주의하고 이것은 부드럽게 잘 측면 벽을 따라 미디어를 추가하여 이루어집니다.
    참고 : 몇 시간 판에 부착된 집계 후 집계에서 neurite 가지를 볼 수 있습니다. Axons 처음 2 주 동안 빠르게 성장하고 집계 (그림 2) 사이의 풍부한 연결을 형성합니다. Glial progenitors 밖으로 집계의 반경 마이 그 레이션 및 astrocytes과 성숙 oligodendrocytes로 시간이 지남에 따라 구별.

그림 1. 세정 후 다른 일 집계에 합산을 형성 세포의 위상 콘트라스트 이미지를 표시합니다.

2 12일 Matrigel - 코팅 coverslips에 씨뿌린 후 집계 문화 그림 2. 위상 콘트라스트 이미지를 표시합니다.

토론

초기 연구는 시냅스 및 회전 - 중재 부유 집계 문화 ¹ 성숙 myelin 형성을보고했다. 여기에 설명된 CNS의 집계 문화 시스템은 세포 개발, 마이 그 레이션 및 체외에서 분화의 분석을 촉진하기 위하여 전통적인 2D 문화의 편의와 입체 집계에 multipotent 전구 세포의 혈청이없는 성장을 결합한 제품입니다. 체제가 신경 전구체에 대한 수정하여 사용할 수 있습니다 세포 연구 및 신경 세포 - glia 상호 작용에 조사를 위해. 예를 들어, oligodendrocyte progenitors으로 유전자 변형 세포는 ² 집계 문화에 추가할 수 있습니다. 이러한 microglia 및 macrophages 또는 뉴런과 glia의 개발 및 차별화에 대한 각종 시약으로 면역 세포의 영향도 공부하실 수 있습니다. 정화 망막 신경절 세포의 Reaggregates은 최근 다른 세포 ^3의 부재에 oligodendrocytes과 cocultures에서...