TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis

요약

이 비디오에서는, 우리는 총 내부 반사율의 형광 (TIRF) 현미경을 사용하여 금붕어 망막 바이폴라 세포에서 단일 시냅스 소포의 exocytosis와 인​​신 매매를 라벨 및 시각화하는 방법을 보여줍니다.

초록

총 내부 반사율 형광 (TIRF) 현미경은 유리 같은 높은 굴절률 물질에 가까운 형광 분자의 선택적 이미징에 의해 세포막에서 일어나는 사건의 연구를 수있게 해주는 기술입니다

프로토콜

1 부 : 해부 및 바이폴라 셀 절연

1. 표 2에 나열된 솔루션을 준비, 링거스 '의 산도는 (외부) 솔루션은 NaOH와 7.4으로 조정되어야하며 내부 솔루션의 산도는 7.2 CsOH로 조정해야합니다. 알루미늄 호일과 빛으로부터 내부 솔루션을 보호하고 4를 유지 ° C를 사용까지;
2. 해부하기 전에 적어도 30 분 금붕어를 어두운 적응;
3. (; 시그마, 세인트 루이스, MO 낮은 칼슘 ^{2 +} 링거스 입력 V의 hyaluronidase, 1100 단위 / ML)과 L - 시스테인 (0.5 MG / ML 10 ML 동물이 어두운 적응하지만, hyaluronidase 5 ML 준비 낮은 칼슘 ^{2 +} 링거스) 솔루션과 papain (동결 건조된 분말, 40 단위 / ML 무게, 소화 솔루션의 5 ML 위해를 시그마, 세인트 루이스, MO);
4. 수술 가위로 빠르게 잘린하여 금붕어를 안락사와 11 # 메스 블레이드와 두뇌 및 척수를 파괴;
5. # 7 곡선 더몬트 집게의 도움으로 추가 - 안구 근육을 파괴하고 홍채 가위로 시신경을 절단하여 눈을 제거;
6. 필터 종이 찔린 11 # 메스 블레이드의 팁과 scleral limbus의 조각에 올려 놓으 아이 전구;

토론

빛이 거리와 함께 기하 급수적으로 방울 년부터 2) 목적 형 TIRF 현미경의 장점은 1) 그함으로써 빛을 - 오브 - 초점 밖으로 최소화 목적의 초점 평면 내의 좁은 지역에 여기 광을 제한함으로써 우수한 광학 sectioning을 제공한다는 점입니다 , 수직 방향으로 움직임은 형광 강도의 변화로 모니터링할 수 있으며, 높은 수치 조리개 목적 ^1.5을 통해 3) 효율적인 조명 컬렉션.

기술의 주요 단점은 그것이 전자 현미경의 ultrathin 섹션와 대략적으로 비슷 세포 표면, 100 & NM 내에서 일어나는 이미징 이벤트로 제한됩니다 것입니다. 따라서 이러한 이벤트의 시각화는 유리에 준수 막의 패치에 가까운 시냅스 리본의 존재와 vesicles의 성공 로딩에 단단히 유리에 준수되는 세포에 매우 다릅니다. 우리 프로토콜은 양극성 세포 시냅스 터미널 ^2,6 이내 vesicles의 총 수를만이 1-2%의 로딩이 가능합니다. 그 말씀을 통해 우리가 이미지 수있는 사람보다 세포의 표면에서 일어나는 많은 이벤트가.......