우리는 정화를 위해 세슘 염화물 밀도 기울기 원심 분리 다음 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출을위한 방법을 설명합니다.
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방법 논문
0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출
이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
이 방법은 스토리지 / 용해 버퍼를 취급하고 -80 ° C에 보관되었습니다 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈 DNA를 추출하고, 세슘 염화물 밀도 기울기를 사용하여이 DNA를 정화하는 데 사용됩니다. 프로토콜은 세포에서 DNA를 해방하고 RNA를 제거하는 방법은 두 한 시간 배양 단계를 시작합니다. 다음으로, 페놀 일련의 : 클로로포름 및 클로로포름 extractions는 단백질과 세포막의 구성 요소, 수성 DNA 추출물의 수집과 추출을 씻어하고 집중 여러 버퍼 교환 단계를 제거하기 위해 원심 분리 다음에 수행됩니다. 부품 다섯 세슘 염화물 농도 기울기를 통해 옵션 정화에 대해 설명합니다. 그것은 혼동을 피하기 및 프로토콜 시간을 줄이려고 한 번에 미만 15 샘플에서 작동하도록 권장합니다. 이 프로토콜에 필요한 총 시간은 추출되는 샘플 수에 따라 달라집니다. 10-15 샘플 및 적절한 원심 분리 장비를 사용할 수있는 가정의 경우이 모든 프로토콜 3 일이 소요됩니다. 당신은 프로세스의 초기에 온도로 설정 하이브 리다이 제이션 오븐을 가지고 있는지 확인하십시오.
프로토콜
참고 :이 프로토콜에서 사용되는 모든 시약이 작동 주식을이 당신의 DNA 샘플 및 연구소 주식 오염의 교차 오염을 방지하는 것이 매우 중요 작은 실험실로 주식에서 aliquoted 있습니다. 또한, pipetting 때 교차 오염을 피하기 위해 모든 외에도 위해 피펫 팁을 변경할 수 있는지 확인하십시오.
부 원 : 세포 용해와 소화
- 얼음 이전에 집중 planktonic의 바이오 매스를 포함 Sterivex 필터를 해동하여이 절차를 시작합니다. 단순 보려면 여기를 우리는 개별 필터를 처리를 위해 절차를 설명합니다. 실제로, 우리는 한 번에 처리 16 또는 이하의 필터를 권장합니다.
- 필터가 해동되면 두 incubations의 첫 시작 : 하나는 세포를 lyse하고 단백질을 분해하는 RNA, 그리고 하나를 제거합니다. 첫 부화 들어, 필터 100 μl 라이 소 자임 (1000 μl TE 125 MG) 20 ML RNase (10 μg / ML)을 추가합니다. Parafilm와 필터를 봉인하고 37 하이브 리다이 제이션 오븐에 ° C 1 시간을 회전 둡니다.
- 다음 부화 들어, 필터 100 μl Proteinase의 K 100 μl 20% SDS를....
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토론
처리하는 방법에 많은 샘플 아르에 따라이 두 한 시간 동안 부화 단계 및 반복 세척과 원심 분리 단계로 인해 시간이 많이 소요되는 절차하실 수 있습니다. 충분한 시간을두고이 절차에 대한 이틀 동안 계획하는 것이 좋습니다. 해당 볼륨이 남은까지 (파트 3 번 반복) 추가 TE의 세척 및 centrifugations하고 시도, DNA 농도 및 세척하는 동안 200 500μl로 줄이기 위해 Amicon 튜브의 마지막 추출 볼륨을 받고 문제가있다면. 추출이 심하게 클로로포름의 냄새가있다면 또한, 그것은 냄새가 클로로포름의 모든이 제거되어 있는지 확인하기 위해 lessens까지 추가로 세척을하는 것이 좋습니다. 다시,이 프로토콜에 사용되는 모든 시약은 작은 작업에 실험실 주식 aliquoted 아르 주식 - 이것은 당신의 DNA 샘플 및 연구소 주식 오염의 교차 오염을 피하기 위해 매우 중요합니다. 또한, pipetting 때 교차 오염을 피하기 위해 모든 외에도 위해 피펫 팁을 변경할 수 있는지 확인하십시오.
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감사의 글
우리는 해안과 열린 바다 바닷물의 낮은 산소 지역에 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금과 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. JJW가 NSERC와 도스의 장학금이 지원되었고 NSERC, 킬람와 툴라 기초 미생물 다양성과 진화에 대한 재정 지원 센터에서 장학금으로 지원했다. SL은 미생물 다양성과 발전을위한 기초 자금 툴라 센터에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1cc 주사기 (26G 5/8 바늘) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1 ml 주사기 (26G 5/8 바늘) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1.5ml 에펜도르프 튜브 | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15ml 튜브 | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5cc 주사기 | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4 원심분리 필터 장치 | EMD Millipore | UFC801096 | 10,000 공칭 분자량 제한치 |
| 부탄올 | Fisher Scientific | A383-1 | 물로 포화시키십시오 (부탄올:물 = 1:1). |
| 원심분리기 로터, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| 원심분리기, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| 염화세슘 | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| 클로로포름:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| 에티듐 브로마이드 (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨염 이수화물 | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| 하이브리다이제이션 오븐 | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| 용해 완충액 | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | ||
| 라이소자임 | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 1000 중 125 mg μl TE |
| 마이크로콘(Microcon)® Ultracel YM-30 원심 분리 필터 유닛 | EMD Millipore | 42410 | 50 bp 컷오프 |
| 파라필름 | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 페놀:클로로포름:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| 프로테이나제 K | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ 청색광 투과조명기 | Invitrogen | S37102 | |
| 소듐 도데실 설페이트 (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| Sterivex 필터 | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| 수크로스 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| 탁상형 원심분리기 | Eppendorf | 5415D | |
| TE 완충액, pH 8.0 | |||
| Trizma® 염기 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 초원심분리기 로터, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| 초원심분리기 튜브 (7X20mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| 초원심분리기 튜브 랙 | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| 초원심분리기, Optima® 최대값 | Beckman Coulter Inc. |
참고문헌
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
