양질의 절연이 손상 RNA는 많은 실험실 프로토콜에서 필수적인 단계입니다. 여기, 우리는 전체 zebrafish의 배아 및 유전자 표현 microarray 분석 등 다양한 실험 절차에 후속 응용 프로그램에 대한 cDNA 합성에서 RNA 추출을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
대부분의 중요하고 복잡한 실험 절차는 고품질, 손상 RNA의 입력을 필요로합니다. 타락한 샘플이나 불순물의 존재는 하류 실험 응용 프로그램에서 치명적인 결과를 초래할 수 있습니다. 그것은 우수한 샘플을 보장하기 위해 다양한 안전 및 품질 관리 검사와 견고한 기술을 사용하는 가장 중요 따라서이다. 여기에, 우리는 세부 상업 RNA 분리 키트를 사용하여 DNA와 불순물의 흔적을 제거하는 상용 화학 denaturant 이후 정리를 사용하여 전체 zebrafish의 배아에서 총 RNA를 분리하는 프로토콜. RNA는 상대적으로 불안정하고 RNAses에 의해 절단 쉽게 경향이 있으므로, 대부분의 프로토콜 분석 유전자 발현 직접 RNA의 템플릿에서 합성되는 cDNA 제품을 사용하고 있습니다. 우리는 세부 절차를 상용 키트를 사용하여보다 안정적인 cDNA 제품에 RNA를 변환합니다. 이러한 절차를 통해 샘플 강등 당하거나 오염되지 않도록하기 위해 다양한 품질 관리 검사가 없습니다. 이러한 프로토콜의 최종 제품은 microarray 분석, RT - PCR 또는 장기 보관에 적합한 것을 cDNA입니다.
프로토콜
1 부 : TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA의 추출
RNA와 함께 작업하는 경우가 RNAses 무료입니다 환경에서 작동하는 것은 매우 중요합니다. 이러한 RNA 절차에만 사용하기 위해 예약된 pipettes가 발생하고 절차를 시작하기 전에 decontaminant 시약 (예 : RNAse 거리)로 작업 영역을 분사와 같은 간단한주의 사항은 매우 도움이됩니다.
- 1.5 ML의 microfuge 튜브에 RNA 수영장 50 zebrafish의 배아 충분한 양의 달성하고 피펫과 함께 가능한 한 많은 물을으로 제거하려면 다음과 같이하십시오.
- 바로 배아를 포함하는 microfuge 튜브에 TRIzol 시약 1 250 μl를 추가합니다. TRIzol 시약은 페놀이 포함되어 있습니다 단 퓸 후드에서 사용해야합니다.
- 조직이 충분히 교란 때까지 펠렛 유봉 (약 20 치기)와 배아를 Lyse 및 균질.
- 세포가 충분히 균질 경우 1 ML 총 볼륨을 동일하기 위해 750 μl TRIzol 시약을 추가합니다.
- 핵 단백질의 단지의 완전한 분리를 허용하려면, 실온에서 5 분 균질 샘플을 품어. 이 단계에서는 예제 플래시 액화 질소에 냉동 및 -80 ° C....
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토론
RNA 분자의 취약성이 프로토콜을 통해 기억되어야하는 가장 중요한 고려 사항이다. RNAse - 무료 살균 장비는 항상 연구실의 RNAse없는 영역에서 사용해야합니다. 단 RNA 절차에 사용하는 실험실의 일부를 예약하는 것이 도움이 그것입니다. 이 지역은 자주 자리 비움 같은 RNAse으로 RNAse 제거 제품과 뿌렸해야합니다. RNA 샘플은 항상 장갑을 착용 한채로 처리하고 저하를 방지하기 위해 얼음에 보관해야합니다.
이 프로토콜은 상용 시약 및 키트를 이용했다. 또한, 다양한 추가 시약 및 총 RNA의 isolations을위한 시장에서 사용 가능한 RNA 분리 키트가 없습니다. 이 프로토콜에 포함된 시약 및 키트는 잘 작동하고 정기적으로 저희 연구실에서 고품질의 RNA를 굴복했습니다.
대안으로, 이중 좌초 cDNA 합성 대신이 프로토콜에서 보여준 최초의 스트랜드 합성의 수행할 수 있습니다. 그것이 증가 안정성을 제공하는 .......
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공개 사항
저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 글라이코겐 (5 mg/ml) | Ambion | 9510 | |
| NanoDrop ND-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-1000 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브용 펠릿 페스틀 | VWR international | KT749520-0090 | |
| Phase Lock Gel Light, 1.5 ml | Eppendorf | 2302800 | |
| 페놀, Tris 포화 | Roche Group | 3117944001 | |
| RNAse Away | VWR international | 17810-491 | |
| RNAse-Free DNase 세트 | Qiagen | 79254 | |
| RNEasy Mini 키트 | Qiagen | 74104 | |
| RT-PCR용 SuperScript® First-Strand Synthesis 시스템 | Invitrogen | 11904-018 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 |
참고문헌
- TRIzol Reagent Manual. , (2007).
- RNEasy Mini Handbook. , 4th ed, (2006).
- SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Version E. (2003).
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재인쇄 및 허가
