Lentivirus 제작

요약

lentiviruses을 만들려면, DNA 벡터는 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 수확 후 뜨는을 집중, 바이러스 titer는 흐름 cytometer로 형광 표현식에 의해 결정됩니다.

초록

RNA 간섭 (RNAi)은 살아있는 세포에서 유전자 입을의 시스템입니다. RNAi에 유전자가 상동 짧은 간섭 RNAS을 순서대로 (siRNA) 포스트 transcriptional 상태에서 침묵하고 있습니다. 짧은 헤어핀 RNAS, siRNA에 엽 성의 전구 물질은 세포 유형의 다양한 RNAi 수있게 lentivirus을 사용하여 표현할 수있다. 같은 인간 면역 결핍 바이러스로 Lentiviruses는, 세포를 분리 및 비 분리를 모두 감염을 수 있습니다. 우리는 어떤 패키지 lentiviruses에 절차를 설명합니다. 포장은 DNA 벡터에서 관할 바이러스의 준비를 말합니다. Lentiviral 벡터 생산 시스템은 자연의 바이러스 게놈은 개인 도우미 플라스미드 구조로 분할되어 '분할'시스템을 기반으로합니다. 네 별도의 벡터로 다른 바이러스 요소의 분할은 lentiviral 게놈의 우발적인 재조합에 의한 복제 가능 바이러스를 생성의 위험을 감소. 여기, 관심을 세 포장 벡터의 shRNA (P - VSVG, pRSV, pMDL)를 포함하는 벡터가 transiently 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 최소한 48 시간 잠복기 후, 바이러스가 포함된 뜨는은 수확과 집중되어 있습니다. 마지막으로, 바이러스 titer는 기자 (형광) 흐름 cytometer와 표현에 의해 결정됩니다.

프로토콜

1 부 : Lentiviruses 생산 HEK 293 세포의 Transfection

* 24시간 50~70% 다음날의 confluency에 10cm 접시에 transfection, 플레이트 2.5 X 10 ⁶ 세포 전에.

1. 하나는 나중에 바이러스를 하나의 세포를 transfect 것입있는 DNA를 준비하여이 절차를 시작합니다. 첫째, FuGENE 6 Transfection 시약 로체, 세포가 DNA를 잡으 지질 시약을 희석. 1.5 ML 튜브에 피펫 30μl FuGENE 6 600ul 혈청없는 매체로 (SFDMEM). 그것이 매체에 전달로 FuGENE은 튜브의 측면을 건드리지 못하게하는주의하십시오. 이 FuGENE 5 분 실온에서 SFDMEM 믹스와 부화하자.
2. 튜브의 뚜껑에서 4 μg 각 제 ^{3 세대} 바이러스성 포장 벡터 (pMDL, pRSV 및 pVSV - G)와 플라스미드 lentiviral 4 μg를 섞는다. lentiviral 플라스미드는 DNA 포장 벡터가 lentivirus하기 위해 필요한 다른 모든 단백질에 대한 유전자를 포함하는 동안 바이러스가, 그것이 감염 모든 세포의 게놈에 삽입됩니다 포함되어 있습니다.
3. 반전 튜브 몇 배 뚜껑과 ....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM, HEK 293T 세포, 페니실린-스트렙토마이신, 글루타민, 인산염 완충 식염수(PBS), FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection 시약, pSico mCherry, pMDL, pRSV, pVSVG	Roche Group
표백제	Clorox
10-cm 세포 배양 접시, 96웰 세포 배양 접시	Falcon BD	353003
멀티채널 파이펫	Rainin
필터 파이펫 팁	Rainin
1.5ml Eppendorf 튜브, 주사기, 주사기 필터 (0.45-μm)	Eppendorf
초원심분리 튜브	Beckman Coulter Inc.
5% CO2 조직 배양 인큐베이터	Coulter
Beckman SW41T.I 로터
Beckman 초원심분리기	Beckman Coulter Inc.
형광 현미경	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.