내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)은 혈관 항상성 및 수리를 공부하는 유망 도구입니다. 1,2이 논문은 절연 및 안티 소 예방 접종의 위험이 떨어지면서 풀링된 인간의 혈소판 lysate (pHPL)와 heparinised 성인 인간의 말초 혈액에서 ECFC의 확장을위한 소설 동물 - 혈청 무료 방법을 소개합니다.
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이 논문에서
요약
초록
본 논문은 heparinized에서 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)에 대한 새로운 복구 전략을 도입하지만, 그렇지 12일의 의미 이내에 성인 인간의 말초 혈액을 unmanipulated. 대규모 확장 후> 1x10 8 ECFCs는 추가적인 테스트를 위해 얻을 수 있습니다. Advantageously pHPL를 사용하여 소 혈청 항원과 인간 세포의 접촉은 제외시킬 수 있습니다. 유동세포계측법 및 immunohistochemistry으로 분리된 세포는 ECFC 및 체외 기능의 구조와 같은 혈관을 형성하는가 matrigel 분석에서 테스트 수있는 특징 수 있습니다. 또한이 세포는 생체내 subcutaneously에 기능, perfused 혈관을 형성하는 마우스 모델에서 주입 수 있습니다. 장기 확장 및 cryopreservation 확산 후, 기능 및 게놈의 안정성은 화석이 보존 되기에 나타납니다. 3,4가
이것은 동물 단백질 무료로 절연 및 확장 방법은 ECFCs 대량를 생성하기 위해 쉽게 적용됩니다.
프로토콜
A.) ECFC ISOLATON
DAY 1 :
- 당신이 시작하기 전에 실험은 세포 배양 매체 내피 성장 중간 2 (EGM - 2)를 준비합니다. (; 모든 시그마, 세인트 루이스, MO 500ml 내피 기초 헤파린 (1000 U / ML의 1ml)로 중간 2 페니실린 / 스트렙토 마이신의 5ml 100x 솔루션을 보완 www.sigmaaldrich.com ), L - 글루타민 (2 MM 최종 농도 ) 50 ML 풀링된 인간의 혈소판의 lysate (pHPL). ; 다음 0.2 ML의 하이드로코티손, 2 ML hFGF - B, 0.5 ML VEGF, 0.5 ML EGF, 0.5 ML IGF - 1과 0.5 ML의 아스코르비 산 (SingleQuots로 제공, 모든 Lonza, 워커스빌, MD 추가 http://www.lonzabioscience.을 COM / ). 무균 여과액 0.2 m - 기공 크기의 500 ML Millipore 진공 필터를 통해 중간. pHPL 작은 혈전을 형성하고 있기 때문에 하나의 매체의 두 가지 필터가 필요할 수 있습니다. 사전 따뜻한 필터링 E....
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토론
이 소설 절연 및 확장 방법이 더 효율적이고 더 적은 시간이 소요 모든 세포 분리합니다 (밀도 기울기가 필요 없습니다)을 피함으로써과 기존 기술보다 비싸 간단하고 효율적인 프로세스입니다. 보빈 항원과 putative 이후 xenoimmunization에 pHPL 연락처를 사용하여 제외됩니다. 문화 기간 동안 작은 혈전이 pHPL에 의한, 양식 수 있습니다. 우리의 경험을 바탕으로 이러한 혈전은 콜로니 형성과 세포 증식이나 기능에 영향을하지 않습니다.
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감사의 글
저자는 훌륭한 기술 지원 pHPL와 Margaretha Frühwirth와 다니엘라 탈러를 제공 박사 Katharina Schallmoser 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Endothelial basal Medium-2 | Lonza Inc. | 500ml | |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | |
| 방부제 무첨가 Heparin | Biochrom AG | EGM-2당 10U/ml | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | EGM-2당 2mM | |
| Penicillin 및 Streptomycin | Sigma-Aldrich | EGM-2당 100U/mL Penicillin 및 100μg/mL Streptomycin | |
| Trypsin/1mM EDTA | Invitrogen | T75 플라스크용 7ml CF-4용 70ml | |
| PBS | |||
| 4층 세포 배양 공장 (CF-4) | Corning | ||
| 멸균 깔때기 | Corning | ||
| T75cm2 배양 플라스크 (통기성 캡 포함) | Corning | ||
| 6 mL vacutainer 튜브 (방부제 무첨가 sodium heparin) | BD Biosciences | 방부제 무첨가 sodium heparin 108 IU/6ml 사전 충전 | |
| 50ml Falcon 튜브 | Falcon BD | ||
| 5ml Stripetts | Costar | ||
| 25ml Stripetts | Costar | ||
| Squeezer | Costar | ||
| 0,2 공극 크기 멸균 필터 | EMD Millipore | EGM-2당 500ml 2개 |
참고문헌
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells vi....
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재인쇄 및 허가
