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이 방법에 보고된 연구에 사용된 리튬 외., 과학 323, 1726년부터 1729년까지 (2009)가 .
현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH) 절차에 결합
ISTH 절차가 4 단계로 나눌 수 있습니다 항원에 특정한 CD8의 1) 인도 표준시의 얼룩 + 조직에서 T 세포 2) 바이러스에 감염된 - RNA + 세포를 감지하는 이쉬, 3) 인도 표준시 - 스테인드 세포와 바이러스 - RNA의 공촛점 현미경 이미징 + 셀, 4) 이미지 분석, 이미지 montages 건설과 tetramer + 및 바이러스 RNA + 세포의 매핑을 포함.
1. 항원에 특정한 CD8의 인도 표준시의 얼룩 + 조직 섹션에서 T 세포.
- vibratome 또는 메스를 사용하여 200 음 두께 섹션으로 신선한 조직을 잘라.
- 칠 vibratome의 멸균 PBS - H와 함께 욕조와 0-2로 진정 ° C.는 다소 가파른 27 °로 vibratome 블레이드 각도를 설정합니다. 가능하면 조직이 저하를 최소화하기 위해 얼음에 차게 보관. 신선한 조직도가 차게되면 vibratome를 사용하여 섹션을하는 것이 더 쉽습니다.
- 외과 가위 또는 0.25 cm 높이 조각으로 작은 약 0.5cm 너비로 메스와 조직을 잘라 버릴거야. 무게는 보트 또는 작은 접시에 조직 조각을 넣고 ° C 녹아 4퍼센트 PBS는 아가로 오스 녹지 낮은 버퍼 ~ 40 커버. 조직은 접시의 바닥과 접촉되어 있는지 확인하십시오. 그들은 부유하면 아래 조직 조각을 밀어. 얼음 고체화. 이것은 일반적으로 3~5분 걸립니다.
- Loctite의 접착제로 코트 vibratome 조직 블록. 포셉를 사용하여 다음 메스와 함께 조직 주위 아가로 오스 컷 신중하게 접착제로 코팅 vibratome 차단하는 연약한 아가로 오스 임베디드 조직을 전송합니다. 그것이 조직 블록에 설정되면 조직의 조각을 이동하지 마십시오. 얼음 약 10 분 정도 건조 보자.
- 마운트 조직 vibratome의 블록과 죽은 느린 전진 속도와 상대적으로 높은 진폭을 사용하여 200um 두께 섹션으로 조직을 잘라. 속도와 진폭 설정은 각 vibratome과 다를 수 있습니다. vibratome를 사용할 수없는, 또는 조직 sectioning vibratome 의무되지 않은 경우, 메스를 사용하여 얇은 스트립에 티슈를 잘라.
- 냉장 PBS - H 1 ML을 포함하는 24 잘 조직 문화 판의 우물에 집합 조직 챔버에 페인트로 섹션을 전송합니다. 각 조직 챔버로 4 조직 섹션에 올려. 고무 밴드와 함께 접시에 실험 샘플 정보 및 보안 뚜껑과 조직 문화 접시의 뚜껑을 라벨.
- 또는 vibratome 잘 넘어가지 마요 조직을 위해, 뱃속 같은 메스 또는 레이저 블레이드 가능 스트립처럼 얇은 절약하실 수 있습니다. 메스 컷 섹션에 대한 잘마다 하나의 섹션을 넣어.
- 즉시 완료 후 절단 조직 염색법으로 진행합니다. 고정까지 항상 저하를 최소화하기 위해 냉장 섹션 보관하십시오. 섹션 밖으로 건조시키지 마십시오. 냉장 무균 PBS - H의 섹션을 유지.
- 0.5 MG / ML FITC 복합 tetramers와 박 이상의 조직이 섹션을 품어. 마우스 또는 솔루션을 차단으로 1:200 희석이 부화에 세포 epitopes, 예를 들어 안티 CD8 항체에서 감독이 아닌 토끼 항체를 포함할 수 있습니다. 이 모든 후속 incubations에 대해 잘 당 1 ML 솔루션을 사용하고, 이것과 4 이후의 모든 incubations ° C 로킹 플랫폼에서 접시와 함께을 수행합니다. 잘 후속 단계에서 솔루션의 교차 오염을 방지하기 위해 비어있는 하나 이상의로 구분하여 여러 실험 샘플을 포함하는 조직 실 보관하십시오.
- 기본 부화 후 20 분 각 냉장 PBS - H 회 (2X)로 섹션을 씻으십시오. 냉장 PBS - H를 포함하는 다른 24 잘 조직 배양 플레이트에 조직 회의소를 전송하여이 작업을 수행합니다. 한 실험 샘플에서 다른에 내용을 드립하지 않도록주의, 조직 회의소를 이동할 때. 모든 후속 incubations 및 세척을위한 유사하게 해당 솔루션을 포함하고 깨끗한 접시에 조직 챔버 스를 전송할 수 있습니다. 섹션은 조직 챔버의 측면에 집착하지 않도록하기 위해 절차를 수행하는 동안 조직 실에서 섹션을 모니터링합니다.
- 신선한 PBS로 고정 섹션은 상온에서 2 시간 동안 4 % paraformaldehyde를 버퍼. 차가운 PBS - H 2X 5 분 각 씻으십시오.
- 1-3일에 대한 솔루션을 차단에서 10000 : 토끼 방지 FITC 항체, 예를 들어 Biodesign1와 부화. 공동 라벨 들어,뿐만 아니라이 부화에 세포 epitopes에서 감독이 아닌 토끼 항체를 포함할 수 있습니다. 이 옵션을 들어, 필요한 경우 epitopes을 폭로하고 침투 사전 번째 배양하는 세포를 차단합니다.
- 사용하는 항체가 포름 알데히드 고정에서 항원 검색을 필요로 세포 epitopes에서 감독 경우, 전자렌지에 0.01M 요소로 끓고 3 회 10 초 때마다 epitopes을 폭로. 각 가열 사이에 2 분 기다리십시오. 끓는 솔루션 우물의 부분을 강제 수있는 매우주의하십시오. 이런 문제가 발생하면, 페인트 브러쉬를 사용하여조직 챔버의 측면에서 섹션을 추진하거나 다시 적절한 조직 챔버의 바닥에 접시의 뚜껑에서. 항체가 필요하지 않으면 항원 검색이 단계를 생략하십시오.
- 이전 두 번째 부화하는 세포 epitopes에서 감독 항체를 사용 permeabolize 및 PBS - H 한 시간 트리톤 X - 100과 2퍼센트 정상 염소 혈청 0.3 %를 포함과 함께 조직 부분에서 세포를 차단하십시오. 그렇다면 0.3 % 트리톤 X - 100 2% 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS - H에 남아 항체 incubations을 수행합니다.
- 둘째 부화 후 몇 시간 20 분 동안 PBS - H의 섹션을 씻으십시오. 세 세척 총 두 번 반복합니다. 적절한 찬란 분류 항체와 최종 부화를 수행합니다. 예를 들어, 염소 방지 - 토끼 Cy3와 염소 방지 마우스 알렉사 488이 솔루션을 차단에 1:1000 각 희석. 1-3일위한 부화. 빛을 꺼버리는의 fluorophores으로 이후이 부화하는 동안 주석 박에있는 접시를 포장하고하여 빛으로부터 보호 구역 보관하십시오.
- 몇 시간 20 분 동안 PBS - H의 섹션을 씻으십시오. 세 세척 총 두 번 반복합니다.
- 이쉬 후 수정 섹션 장소에 안전 tetramers 및 항체 1 시간 동안 4 % paraformaldehyde에 포스트 수정과 함께 인도 표준시 들어, 다음에 다시와 마운트 PBS - H와 섹션을 씻어.
- 현미경 슬라이드에 섹션을 전송하는 페인트를 사용하십시오. 글리세롤 / 젤라틴이 포함된 4mg/ml N - 프로필 gallate 또는 coverslip와 형광단의 방부제 및 커버를 포함하는 다른 실장 매체와 문장의 각 섹션을 참조하십시오. 스토어 -20 °에서 조명의 보호 슬라이드 컨테이너에 슬라이드. 조직 문화 접시를 씻어 알코올로 피부에 라벨을 제거합니다. 접시를 재사 용할 수 있습니다.
- 공촛점 현미경으로 스테인드 조직 섹션을 분석합니다. 다음 이쉬을 진행할 수 있습니다.
2. 현장 하이브 리다이 제이션에 의해 바이러스에 감염된 - RNA + 세포를 감지합니다.
현장 하이브리드화 프로토콜이 다음과 같이 4,5의 이전에 게시된 프로토콜에서 바뀌었습니다 :
- 현장 tetramer 자국이 섹션의 두께에서 다시 절단 5-8 마이크론 두께 - sectionss.
- 200 마이크론 두께 - 섹션은 ° C 5 분 슬라이드에서 섹션을 분리하기 위해 70 가열됩니다.
- 섹션 다음 드라이 아이스에 대한 OCT에 모두 담겨있다.
- 8 미크론 섹션은 두께 섹션에서 그라 이오 스탯로 잘라 슬라이드 silanized을 준수하고 있습니다.
- 슬라이드는 ° C 이후의 밀폐된 상자에 원위치 하이브리드화에서 -80에 저장할 수 있습니다.
- 원위치 하이브리드화에서
- 90 % 에탄올과 DEPC - 처리된 물에 3 분, 각 슬라이드를 immersing하여 조직 섹션을 Rehydrate.
- ° C 물 목욕 15 분 98시 10mM 구연 산염 버퍼 (산도 6.0)에 가열하여 조직 섹션을 Permeabilize.
- 20-30 분 실온에서 시원한 조직 섹션.
- 3 분위한 DEPC - 처리된 물에 두 번 씻으십시오.
- 10 분 0.1 M 차 (triethanolamine, pH8.0)에 0.25 % 아세트산 무수물에서 슬라이드를 immersing하여 조직 섹션을 Acetylate.
- 5 분 0.1 M 차 (pH8.0)에 슬라이드를 전송합니다.
- 섹션 35 S - 표시 바이러스 특정 안티 센스 탐침 또는 감각 (HIV - 1에 대한 부정적인 제어, SIV), 또는 35 S - 표시 LCMV의 riboprobes (풀링 감각과 안티 센스) (예 : HIV - 1, SIV와 같은).을 잡종
- 42 밤새 하이브리드화 후 5 분 2xSSC와 두 섹션을 씻어 ° C.
- 5 분 인트에 섹션 (0.5 M NaCL, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5) 씻으십시오.
- 30 분 37 RNases 인트 A와 T1 ° C로 섹션을 다이제스트
- 2X SSC의 섹션 플러스 5 분 50 % 포름 아미드 씻으십시오.
- 1X SSC 10 분에 섹션을 씻으십시오.
- 0.5 X SSC 15 분 섹션을 씻으십시오.
- 70 섹션, 80 및 0.3 M의 암모늄 아세테이트, 각 5 분을 포함하는 100 % 에탄올을 탈수.
- 핵 트랙 에멀젼과 함께 코트 섹션
- 1 시간 동안 어두운 방에서 건조.
- 4 섹션을 노출 ° C 11일 (SIV)와 3 일 (LCMV)에 대한.
- 3 분 (코닥, 고양이 # 146 4,593) D19에 섹션을 개발 dH2O 30 초 세척, 4 분 (코닥, 고양이 # 146 4106) 신속한 해결사에서 해결, dH2O 5 분 × 3 회 씻는다.
- 70 %, 80 % 절대 에탄올, 5 분 각 탈수.
- 형광 호환 Permount 매체에 마운트 슬라이드.
3. 공촛점 현미경 이미지를 수집.
- 바이오 - 래드 MRC 1000 공촛점 현미경, 또는 Epi2 - 블루 반사 장치와 다른 공촛점 현미경으로 ISTH 이미지를 캡처합니다.
- (LCMV 용) 붉은 tetramer fluorochrome, 더 그린 CD8 fluorochrome에 대한 Epi2 - 522 DF32, 그리고 은색 곡물에 대한 Epi2 - 블루 리플렉션 (개발 radioautographs에 이쉬 신호) 20x에서 (SIV) 또는 60x에 대한 Epi1 - 605을 사용하여
- 순차적으로 각 필드의 세 채널에서 1 마이크론 간격으로 Z - 시리얼 이미지를 수집합니다.
- 왼쪽에서 각 섹션에서 이미지를 획득엑셀 파일에 해당 행 및 열에 따라 오른쪽과 아래쪽 맨, 이름과 각 이미지.
- 복원 몬티지 이미지의 격차를 방지하기 위해 이웃 이미지와 함께 ~ 20 %의 중복 각 이미지를 캡처합니다.
4. 이미지 분석 : 몽타주 이미지 재건, 세포 중심 계산 및 공간적 분석.
- 공촛점 길잡이 (버전 4.02.) 각 채널에 대해 하나의 이미지로 프로젝트 Z - 시리얼 이미지.
- 자동으로 포토샵 7.0 작업 절차를 사용하여 하나의 RGB 이미지로 3 채널의 예상 이미지를 병합합니다.
- 포토샵 7.0에서 레이어에 함께 병합된 이미지를 바느질하여 몽타주 이미지를 생성합니다.
- 연결 개별 실버 입자와 tetramer는 세포와 얼룩, 그리고 X를 지정, Y는 MetaMorph (버전 7.1.3.) 또는 포토샵을 (저자에서 제공)를 사용하여, SIV RNA +와 tetramer + 세포의 센터 (centroids)의 좌표
- 각 셀에 대해 숫자 숫자로 Excel 파일에 중심 데이터를 내보냅니다. E : T 비율이 섹션의 tetramer의 총 숫자 +와 바이러스 RNA + 세포에서 Excel 파일에서 결정됩니다.
빨간색과 파란색 tetramer + SIV RNA 사이의 공간적 관계 + 세포는 포토샵 문서에 엑셀 파일에서 각각의 플롯을 복사 및 붙여넣기에 의해 캡처됩니다. 그들이 색상을 선택하고 복사와 푸른 RNA + 세포의 위치 새 레이어에 붙여넣기, 일치 있도록 그리드를 정렬하고 확장할 수있는 레이어의 불투명도 후 그리드를 정렬하는 데 사용 폐기 레이어의 위치를 감소 후 tetramer의 +와 바이러스 RNA의 + 세포는 평평 이미지에 공개됩니다.
5. 추가 정보
감염 조직을 절단하는 경우 :
BSL2.5 연구소에서 작동합니다. 면도날과 특별한 예방 조치를 가져가라. 포셉로 vibratome 블레이드 마운트에 면도칼을 넣어. 당신이 집게로 칼날을 세울 수 없을 경우에는 목욕에 조직을 추가하기 전에 그것을 넣어 칼날을 교체하지 않습니다. 완료 절단 때 집게와 블레이드를 제거합니다. 사전 제거 70 % EtOH 또는 DMQ로 스프레이 블레이드. 언제나처럼, 샵스 컨테이너에 블레이드 처분. 외부 장갑을 변경 또는 조직이나 탱크에 오염된 PBS 각 연락 후 살균제에 린스. 완료되면, 전염성 물질과 함께 일하고있다면, 탱크에 PBS로 DMQ의 살균제를 추가하고 제거하기 전에 몇 분 앉아 보자. 하수구 소독 PBS의 배출. 그런 다음 소금과 살균제를 제거하는 물 탱크를 씻어. DMQ로 클린 작업 공간 및 주방기구. 물을 식기를 씻어.
biotinylated MHC 단량체에서 tetramers을 만들려면 :
나 같은 분자 biotinylated MHC 클래스를 구하는 HLA - A * 0201 / B 2m / 중 개그 (SLYNTVATL) 베크맨 쿨터에서 폴 (ILKEPVHGV) 또는없는 마트 펩타이드 (ELAGIGILTV) 펩티드와 펩티드 분자 생산. Biotinylated HLA - A * 중 개그 (KIRLRPGGK) 또는 NIAID tetramer 시설에서 NEF (QVPLRPMTYK)와 생산된 0301 / B 2m / 펩티드 분자. Tetramers이 분류 FITC 6 aliquots를 추가하여 생성됩니다 biotinylated Mamu에 ExtraAvidin (시그마) * 01 / B 2m / 4.5:1의 마지막 어금니 비율 8 시간 코스 이상의 펩타이드 단량체. Extravidin 추가 뒤에 근거 천천히 초기 시간 지점 동안 Extravidin의 모든 바운드 네 가지 비오틴 사이트를 얻을 수 추가한 보장 모노머의 넘쳐나는있다는 것입니다. ExtrAvidin가 바운드 모든 4 사이트를하지 않을 가능성이 덜 모노머 왼쪽보다가 있기 때문에 나중에 반응으로,이 과정은 덜 효율적이다. 한번에 ExtrAvidin 모두를 추가한 경우 반응은 덜 효율적인 것입니다 더 Extravidin 분자는 2 또는 3 단량체가 첨부된 것이다.