토양 미생물 커뮤니티의 높은 분자량과 높은 품질의 게놈 DNA를 분리하는 방법이 설명되어 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
토양 microbiome이 속속들이 지상파 생태계 내에서 영양과 에너지 흐름과 관련된 게놈 다양성과 신진 대사 혁신의 광대한 상대적으로 미개척 저수지입니다. 또한 metagenomic로 알려진 육성 독립 환경 게놈, 접근 방식은 높은 가치 치료 및 바이오 매스 변환 프로세스에 대한 경로 재건 및 기능 검사와 관련이 유전 정보에 대한 전례없는 접근을 약속드립니다. 그러나, 토양 microbiome은 여전히 큰 삽입 라이브러리 생산을위한 충분한 품질의 높은 분자량의 DNA를 얻는의 어려움으로 인해 크게 도전 남아있다. 여기 우리는 토양과 퇴적물에서 높은 분자량, 미생물 지역 사회 게놈 DNA를 추출하기위한 프로토콜을 소개합니다. 절연 게놈의 DNA의 품질은 하류 시퀀싱 및 심사 애플 리케이션을위한 대형 삽입 환경 게놈 라이브러리를 구축에 이상적입니다.
절차는 세포 용해와 함께 시작합니다. 세포 벽 및 미생물의 세포막은 두 기계 (연삭)와 화학 세력 (β - 메르 캅 토 에탄올)에 의해 lysed 있습니다. 게놈 DNA는 다음 추출 버퍼, 클로로포름 - isoamyl 알콜과 이소 프로필 알코올을 사용하여 격리됩니다. 용해와 추출 단계에 대한 고용 버퍼는 구아니딘의 isothiocyanate 및 높은 분자량의 게놈의 DNA의 무결성을 유지 hexadecyltrimethylammonium의 브로마이드 (CTAB)를 포함합니다. 귀하의 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 분리된 게놈의 DNA가 더 세슘 염화물 (CsCl) humic 지방산을 포함하여 불순물을 감소 기울기 ultracentrifugation을 사용하여 정화 수 있습니다. 첫 번째 절차, 추출, DNA의 양을 정함 단계 제외한 약 8 시간 정도 소요됩니다. CsCl ultracentrifugation 기울기는 이틀 과정입니다. 전체 절차를 수행하는 동안, 게놈 DNA는 전단을 방지하기 위해 부드럽게 다루어야하는, 심각한 vortexing을 방지하고, 거칠 반복적인 pipetting.
프로토콜
부품 I : DNA의 추출
절차
1. 8시간는 DNA의 양을 정함을 제외한 6 샘플 처리를 위해, 필요합니다.
당신이 추출을 시작하기 전에, 당신은 사전 진정 박격포, 유봉 및 -20 ° C의 냉동고에 주걱이나 액체 질소를 사용해야합니다. 또한, 얼음 20 ML 클로로포름 isoamyl 알콜 (24:1)를 포함하는 사전 진정 50 ML 튜브. 65 하이브 리다이 제이션 오븐을 설정 ° C 미리 열 수 있습니다. 그것 ° C 크리스탈을 녹일 60 따뜻한 크리스털 경우, CTAB 솔루션을 확인하십시오. 당신이 추출 (아래 제조법 참조)을 시작하기 직전 마지막으로 재료를 추가하여 denaturing 솔루션 및 추출 버퍼를 완료하십시오. 펌 후드의 모든 추출 절차를 실시합니다.
2. denaturing 버퍼와 추출 버퍼를 준비합니다.
참고 : DNA의 수율을 최대화하기 위해서는 정확하게 지침에 따라 버퍼를 만들기 위해 중요합니다.
3. 미리 차게 절구에 흙 2g를 놓습니다.
참고 : 현장에서....
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감사의 글
우리는 산림 토양의 생산성의 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금, 게놈 브리티시 컬럼비아과 숲의 브리티시 컬럼비아 교육부와 범위에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. SL은 미생물 다양성과 발전을위한 기초 자금 툴라 센터에서 화목에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
조리법
* 솔루션을 Denaturing
4 M 구아니딘의 isothiocyanate
10 MM 트리스 - HCL (산도 7.0)
1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)
0.5 % 2 - 메르 캅 토 에탄올
| Denaturing 솔루션 : 총 10 ML | |
| 구아니딘의 isothiocyanate (MW 118.16) | 4.73 g |
| 1M 트리스 - HCL (산도 7.0) | 100 μl |
| 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 20 μl |
| 총 9.95 ML 물을 추가합니다. | |
| 압력솥. | |
| 바로 사용하기 전에 50 μl 2 - 메르 캅 토 에탄올을 추가합니다. (1 ML Denaturing 솔루션 당 2 - 메르 캅 토 에탄올 5 μl) 참고 : 4 Denaturing 솔루션을 유지 ° C. 일주 이상의 버퍼가 이상 사용하지 마십시오. 가능하면 신선한 버퍼 사용합니다. | |
** 추출 버퍼
100 MM 나트륨 인산염 버퍼 [산도 7.0]
100 MM 트리스 - HCL [산도 7.0]
100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) [산도 8.0]
1.5 M NaCl
1 % Hexadecyltrimethylammonium의 브로마이드 (CTAB)
2퍼센트 SDS
| 총 1 L에 대한 추출 버퍼 | |
| 1M 나트륨 인산염 버퍼 [산도 7.0] * | 100 ML |
| 1M 트리스 - HCL [산도 7.0] | 100 ML |
| 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) [산도 8.0] | 200 ML |
| 5 M NaCl | 300 ML |
| 압력솥과 실온에서 보관. | |
| 200ml, 5 % Hexadecyltrimethylammonium의 브로마이드 (CTAB, autoclaved) 100 ML, 20 % SDS (autoclaved) 바로 사용하기 전에를 추가합니다. CTAB가 크리스털 경우, 60을 용융 ° C. * 1M 인산 나트륨 완충액 : 57.7 ML, 1M 인산 나트륨 일염기의 (아니 2 PO 4) 42.3 ML, 1M 인산 나트륨 이염 (아니 2 PO 4). 7.0 산도를 조정 참고 :이 석출이있다면 20% SDS를 사용하지 마십시오. 당신이 솔루션에 SDS를 추가할 때 밀키 정학을 볼 정상입니다. 일단, SDS를 추가 60 추출 버퍼를 배치 ° C는 SDS가 잘 일시 중지되도록합니다. | |
참고문헌
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Steri....
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