의 분리 및 정제 Drosophila 주변 뉴런

요약

이 동영상 기사에서 우리는의 분리 및 정제를위한 방법을 제시 Drosophila 주변 뉴런. 분리된 세포에서 얻은 RNA는 쉽게 microarray 분석을 포함하여 하류 어플 리케이션에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

Drosophila 주변의 뉴런의 마그네틱 비드 정렬에 대한 일반 댓글 (의정서의 완료에 대한 총 타이밍 : 2.5-3 시간)

깨끗하고 RNAse 무료로 환경을 유지하기위한 표준 실험실 절차 RNA 저하를 방지하기 위해 항상 준수해야합니다.

Drosophila 애벌레의 표피가 해부 및 세포 분리 버퍼에 배치되면, 주변 신경은 표피에서 분리 마지막 셀 중 하나입니다. 우리는이 속성을 악용 등 근육 사전 검사의 뉴런을 분리하기 위해 지방으로 표피의 불특정 세포의 대부분을 제거하는이 프로토콜을 설계했습니다.

연습, 전체 프로토콜은 성공적으로 약 2.5 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 실험이 시작되기 전에 항체 코팅 구슬의 준비는 완료해야합니다.

1. 바인딩 전지 자기 비즈 준비 :

이 단계는 이전 실험의 시작을 완료해야합니다. 준비 구슬이 필요 ° C까지 4 준비하고 저장할 수 있습니다.

1. 신선한 PBS 500 μl에 resuspending하고 강력한 자장의 각 시간을 pelleting하여....

토론

여기에 제시 프로토콜은 자기 비드 셀 정렬 전략을 사용하여 Drosophila 셋째 instar 애벌레의 표피의 내부 표면에 단단히 고수 주변 뉴런의 분리 및 정제에 최적입니다. 우리가 구체적으로 애벌레 또는 개발의 pupal 단계에있는 표피에 맞게 다른 세포 유형의 고립이 프로토콜의 Drosophila 뭐냐 뉴런, 응용 프로그램을 분리하기 위해이 프로토콜을 사용하는 동안 (예 : 상피 조직, 근육, 기타 말초 신경)에 적용할 수 있습니다 세포 유형이나 관심의 종류를 분류 UAS - mCD8 - GFP의 기자 transgenes는 몇 가지 매개 변수를 변화 독특한 GAL4를 사용합니다. 또한,이 프로토콜은 관심사의 유전자가 하나 직접하는 GAL4 transgene와 결합 수있는 UAS - mCD8 - GFP의 transgene에 복제됩니다 손실의 기능과 이득의 기능의 접근법 모두에서 사용할 수있는 유전자를 구체적인 손실의 기능 (예 : UA.......

재료

장비

• 또는 ™ -2 DynaMag (10) 네오디뮴 자석 블록 (K & J 자기학, 주식, 고양이. # B444B), (Invitrogen, 고양이를. # 123 - 21D)를 사용할 수 있습니다.
• 대형 통관 유봉과 함께 Kontes 유리 조직 그라인더, 2 ML 작업 능력 (Cat. # 885300-0002)
• 세포 필터 예 맥 사전 분리 필터 (Miltenyi Biotec, 고양이. # 130-041-407)
• 35mm 배양 - 요리 Sylgard (다우 코닝 주식 회사, 고양이. # 3097358-1004)로 코팅
• 해부 도구 : 더몬트 제 5 포셉 두 쌍 (파인 과학 도구, 고양이 # 11251-20).
• Vannas 봄 마이크로 해부 가위 (파인 과학 도구, 고양이. # 15000-08)
• 일회용 팁을 Pipettes (P - 1000, P - 100, P - 10)
• 셀 및 견적 순도를 계산하는 표준 hemocytometer
• 표준 직경 화재 광택 팁을 파스퇴르 pipettes은 표준 직경 ~ 50 % 범위를 압축 및 분쇄를위한 표준 직경 ~ 25 % 줄여주
• 테이블 상단 마이크로 원심 분리기 (1-16,000 (X) G)
• 와동
• 형광등 스테레오 현미경 (Leica MZ16FA이 프로토콜에 사용되었습니다)