인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

요약

사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수 있습니다 생체내에. 여기, 우리는 소설을 제시 체외에서 접근되는 미리 mRNA의 선택 지역에 걸쳐 타일.

초록

RNA 결합 단백질과 공동 immunoprecipitate (CO - IP)는 해당 바인딩 위치를 입증하여 splicing 우리의 이해를 증가했음을 RNAS를 배열하는 것은 종종 splicing 요소의 기능에 영향을 미칩니다. 그러나, 같은 샘플링 전략 splicing 요소에 바인딩된 RNA를 식별의 기회는 셀룰러 풍요에 비례합니다. 우리는 사전 mRNA 달리 과도에 대한 결합 특이성을 조사에 대한 체외 방식의 소설을 개발했습니다. 이 방법은 특별히 설계된 oligonucleotide 풀을 활용되는 introns, exons, 스플 라이스 분기점 또는 사전 mRNA 기타 전체 타일. 수영장은 분자 선택 어떤 종류의를 받게됩니다. 여기, 우리는 바운드와 언바운드 분수에 oligonucleotide를 분리하여 방법을 설명하고 바운드 분수의 각 oligonucleotide의 강화를 기록 두 색상 배열 전략을 사용합니다. 배열 데이터는 순서 특정 및 구조 사전 mRNA에 대한 구속력을 ribonucleoprotein (RNP)의 determinates 식별하는 능력을 가지고 고해상도지도를 생성합니다. 수영장이 특별히 사전 mRNA 순서에서 설계하고 합성이므로이 방법으로 독특한 장점은, 현재 IP와 S​​ELEX 기법과 관련된 mRNA 대한 샘플링 바이어스를 방지하는 기능입니다. 실험자들이 그들의 개인적인 필요에 수영장을 조정, 전체 연구 기와하는 지역을 선택 이후 oligonucleotide 수영장의 유연성은 또 다른 장점이라고 생각합니다. 이 기법을 사용, 하나는 분석 대규모 구속 또는 기능 splicing 기자로 라이브러리를 복제하고 포함 분수에 농축되는 oligonucleotides를 식별에 polymorphisms이나 돌연변이의 효과를하실 수 있습니다. 체외 고해상도 매핑 스키마에서이 소설은 낮은 풍부한 생체내 기술의 현재와 공부하기 어렵 만드는 과도 사전 mRNA 종과 RNP 상호 작용을 연구하는 독특한 방법을 제공합니다.

프로토콜

풀 디자인과 oligo 복구

1. 첫 번째 단계는 공부하는 사전 mRNA 수영장을 설계하는 것입니다. 이것은 UCSC 게놈 브라우저를 사용하고 특정 유전자, 스플 라이스 분기점, 또는 관심있는 다른 분야를 다운로드 할 수 있습니다.
2. 관심 창문이 선택되고 나면, 그들에 걸쳐 타일이 계산은 다음 조건을 사용하여 읽을 수 길이는 따라서 각 oligo가 이전부터 20 세포핵을 이동하는 10 염기 오버랩, 30 세포핵해야합니다. * Oligo의 중복은 적절한 범위를 보장하기 위해 스플 라이스 사이트에 가까이 증가한다; 10-20 세포핵에서 중복을 증가하면이 작업을 수행할 수 있습니다.
3. 수영장의 하류를 증폭하는 데 사용됩니다 보편적인 뇌관 시퀀스, 각 30 염기 oligo 측면. 기와 oligo 주문은 시퀀스가​​ 지정 oligonucleotide microarray의 인쇄됩니다 애질런트에 제출하여야한다.
4. microarray 표면에서 DNA를 oligos를 복구하기 위해서는 슬라이드에 배열 하이브 리다이 제이션 챔버의 배열 커버 슬라이드를 삽입하고 부드럽게 DH ₂ O 500 μL를 pipetting으로 시작
5. 표지 슬라이드 위에 샌드위치 배열, 프로세스를 중단 할 수 공기 방울을 피하기 위해주의한....

토론

수영장의 생성을 기억하는이 절차는 중요 할 때하면 RNA 또는 단백질 수준 중 하나에서 유연하고 수정하기 위해 열려 있습니다. RNA 수준에서 orthologous 지역 질병 돌연변이, polymorphisms, 또는 무작위 돌연변이 oligonucleotide 순서에 소개하실 수 있습니다. 단백질 수준에서 RNA 바인딩 요소는 인산화 또는 다른 게시 translational 수정하여 수정할 수 있습니다. 또한 바인딩 환경 중 상호 작용이나 관심의 RNA 결합 단백질과 경쟁할 추가 요인의 수준을 증가 또는 감소로 조작할 수 있습니다.

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