효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

Summary

우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다.

Abstract

우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다. 선형 λ DNA는 한 가닥의 끝 부분에 비오틴과 같은 스트랜드의 다른 끝에 dig​​oxigenin의 잔기을 가지고 수정됩니다. biotinylated 결국은 기능화 유리 coverslip과 작은 구슬로 digoxigeninated 끝에 첨부되어 있습니다. 흐름 세포의 표면에 이러한 DNA - 비즈 tethers의 조립이 층류가 구슬에 드래그 힘을 발휘에 적용할 수 있습니다. 결과적으로 DNA가와 병렬 유량 (그림 1)에 의해 결정됩니다 강제에 coverslip의 표면 가까이에 뻗어있다. DNA의 길이는 비드의 위치를​​ 모니터링하여 측정됩니다. 단일 및 이중 좌초된 DNA 사이의 길이 차이는 분기점에서 복제 단백질의 활동에 대한 실시간 정보를 얻을 활용하고 있습니다. 비드의 위치를​​ 측정하는 것은 긴장을 풀기 DNA와 중합 (그림 2)의 속도와 processivities의 정확한 결정을하실 수 있습니다.

Protocol

1. DNA 복제 템플릿

반응에 대한 DNA가 복제 포크를 형성 oligonucleotides의 어닐링에 의해 수정된 선형 λ의 DNA입니다. 또한, 비오틴은 λ의 DNA 중 한 가닥의 끝 부분에 첨부하고, digoxigenin의 잔기가 같은 스트랜드 ¹ 상대방에 첨부되어 있습니다.

자료 : 박테리오 파지 λ의 DNA, Oligonucleotides : biotinylated 포크 팔 (A : 5' - 비오틴 - AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC - 3 '), λ - 보완 포크 팔 (B : 5' - GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATATGGCA - 3'), 포크 프라이머 (C : 5 ' - TGCCATATCTGAAATCCTCCCTGC - 3 '), λ - 보완 digoxigenin 엔드 (D : 5' - AGGTCG CCGCCCAAAAAAAAAAAA - digoxigenin - 3'), T4 DNA Ligase의, T4 폴리 뉴클레오 타이....

Discussion

층류 흐름에 의해 구슬을 끼쳤다 드래그 팀은 복제 단백질의 효소 활동에 영향을 미치지 않도록하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 0.012 ML / 분 유량에 해당하는 3 PN 인력은 DNA 선도 가닥의 복제에는 영향을 미치지 않습니다. 그것은 그러나 조정의 DNA 합성 동안을 효소 활동에 영향을 미치지 않으며, 그것은 따라서 1.5 PN을 줄일 수있다. 드래그 힘을 쉽게 유속 또는 유량 채널 ⁵ 너비를 변경하여 제어할 수 있습니다.

분석에 이르는 DNA 사이 이중 및 단일 좌초된 DNA의 길이 차이를 고용합니다. 실험 ssDNA 여기 dsDNA의 변환을 설명하는 것은 최고의 스트랜드 합성 (그림 2)의 결과로 발생합니다. 당신은 ssDNA 6 PN 아래 낮은 스트레칭 세력 (그림 1)에서만 dsDNA보다 짧은 것을 기억한다.

이 방법의 개선 가능성은 3' - 끝에 두 번째 구슬을 첨부하여 복제 템플.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
박테리오파지 λ DNA	New England Biolabs	N3011L
DNA 올리고뉴클레오티드	통합 DNA 기술
T4 DNA 리가제	New England Biolabs	M0202L
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제	New England Biolabs	M0201L
α-digoxigenin Fab	Roche Group	11214667001
Tosyl Activated Beads	Invitrogen	142-03
자기 분리기	Invitrogen	Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648	다른 아미노실란을 사용하거나 더 희박한 표면을 위해 비아민 반응성 실란과 혼합할 수 있습니다
Succinimidyl propionate PEG,	Nektar		유사한 PEG는 Nanocs, CreativePEGWorks 등에서 구입할 수 있습니다.
Biotin-PEG-NHS	Nektar		유사한 PEG는 Nanocs, CreativePEGWorks 등에서 구입할 수 있습니다.
양면 테이프	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	100 μ m 두께
석영 슬라이드	테크니컬 유리	20mm(W)x 50mm(L)x 1mm(H)	커버슬립에 맞는 크기. 다이아몬드 팁 드릴 비트로 구멍을 뚫습니다 (DiamondBurs.net)
폴리에틸렌 튜빙	BD Biosciences	427416	0.76 mm ID, 1.22 OD 다른 크기의 튜빙으로 대체할 수 있습니다.
Streptavidin	Sigma-Aldrich	S4762	Make 1 mg/mL 용액, 25 μ L PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate 용액 혼합물	New England Biolabs	N0447
도립 광학 현미경 10X 대물렌즈	Olympus Corporation	Olympus IX-51
Permament 희토류 자석	국내 수입	www.rare-earth-magnets.com
CCD 카메라	QImaging	Rolera-XR Fast 139
주사기 펌프	Harvard Apparatus	11 Plus	용액 교체를 용이하게 하기 위해 리필 모드에서 작동
Fiber Illuminator	Thorlabs Inc.	OSL1