우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다. 선형 λ DNA는 한 가닥의 끝 부분에 비오틴과 같은 스트랜드의 다른 끝에 digoxigenin의 잔기을 가지고 수정됩니다. biotinylated 결국은 기능화 유리 coverslip과 작은 구슬로 digoxigeninated 끝에 첨부되어 있습니다. 흐름 세포의 표면에 이러한 DNA - 비즈 tethers의 조립이 층류가 구슬에 드래그 힘을 발휘에 적용할 수 있습니다. 결과적으로 DNA가와 병렬 유량 (그림 1)에 의해 결정됩니다 강제에 coverslip의 표면 가까이에 뻗어있다. DNA의 길이는 비드의 위치를 모니터링하여 측정됩니다. 단일 및 이중 좌초된 DNA 사이의 길이 차이는 분기점에서 복제 단백질의 활동에 대한 실시간 정보를 얻을 활용하고 있습니다. 비드의 위치를 측정하는 것은 긴장을 풀기 DNA와 중합 (그림 2)의 속도와 processivities의 정확한 결정을하실 수 있습니다.
프로토콜
1. DNA 복제 템플릿
반응에 대한 DNA가 복제 포크를 형성 oligonucleotides의 어닐링에 의해 수정된 선형 λ의 DNA입니다. 또한, 비오틴은 λ의 DNA 중 한 가닥의 끝 부분에 첨부하고, digoxigenin의 잔기가 같은 스트랜드 1 상대방에 첨부되어 있습니다.
자료 : 박테리오 파지 λ의 DNA, Oligonucleotides : biotinylated 포크 팔 (A : 5' - 비오틴 - AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC - 3 '), λ - 보완 포크 팔 (B : 5' - GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATATGGCA - 3'), 포크 프라이머 (C : 5 ' - TGCCATATCTGAAATCCTCCCTGC - 3 '), λ - 보완 digoxigenin 엔드 (D : 5' - AGGTCG CCGCCCAAAAAAAAAAAA - digoxigenin - 3'), T4 DNA Ligase의, T4 폴리 뉴클레오 타이....
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토론
층류 흐름에 의해 구슬을 끼쳤다 드래그 팀은 복제 단백질의 효소 활동에 영향을 미치지 않도록하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 0.012 ML / 분 유량에 해당하는 3 PN 인력은 DNA 선도 가닥의 복제에는 영향을 미치지 않습니다. 그것은 그러나 조정의 DNA 합성 동안을 효소 활동에 영향을 미치지 않으며, 그것은 따라서 1.5 PN을 줄일 수있다. 드래그 힘을 쉽게 유속 또는 유량 채널 5 너비를 변경하여 제어할 수 있습니다.
분석에 이르는 DNA 사이 이중 및 단일 좌초된 DNA의 길이 차이를 고용합니다. 실험 ssDNA 여기 dsDNA의 변환을 설명하는 것은 최고의 스트랜드 합성 (그림 2)의 결과로 발생합니다. 당신은 ssDNA 6 PN 아래 낮은 스트레칭 세력 (그림 1)에서만 dsDNA보다 짧은 것을 기억한다.
이 방법의 개선 가능성은 3' - 끝에 두 번째 구슬을 첨부하여 복제 템플.......
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감사의 글
분석에 이르는 DNA의 발전은 폴 Blainey, 종 봉과 사미르 Hamdan하여 주었되었습니다. 이 작품은 찰스 리차드슨 (GM54397), 그리고 안토니 반 Oijen (GM077248)로 건강을 부여의 국립 연구소에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 박테리오파지 λ DNA | New England Biolabs | N3011L | |
| DNA 올리고뉴클레오타이드 | Integrated DNA Technologies | ||
| T4 DNA 리가아제 | New England Biolabs | M0202L | |
| T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 | New England Biolabs | M0201L | |
| α-디곡시게닌 Fab | Roche Group | 11214667001 | |
| 토실 활성화 비드 | Invitrogen | 142-03 | |
| 자기 분리기 | Invitrogen | Dynal MPC | |
| 3-아미노프로필-트리에톡시실란 | Sigma-Aldrich | A3648 | 표면 밀도를 낮추기 위해 다른 아미노실란을 사용하거나 비아민 반응성 실란과 혼합하여 사용할 수 있음 |
| 석신이미딜 프로피오네이트 PEG | Nektar | 유사한 PEG는 Nanocs, CreativePEGWorks 등에서 구입 가능함 | |
| Biotin-PEG-NHS | Nektar | 유사한 PEG는 Nanocs, CreativePEGWorks 등에서 구입 가능함 | |
| 양면 테이프 | Grace Bio-Lab Inc. | SA-S-1L | 두께 100 μm |
| 쿼츠 슬라이드 | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) | 커버슬립에 맞는 크기. 다이아몬드 팁 드릴 비트(DiamondBurs.net)로 구멍을 뚫을 것 |
| 폴리에틸렌 튜빙 | BD Biosciences | 427416 | 내경 0.76 mm, 외경 1.22 mm 다른 크기의 튜빙으로 대체 가능함 |
| 스트렙타비딘 | Sigma-Aldrich | S4762 | PBS pH 7.3에서 1 mg/mL 용액으로 제조하여 25 μL씩 분주함 |
| 데옥시리보뉴클레오타이드 삼인산 혼합 용액 | New England Biolabs | N0447 | |
| 10배 대물렌즈 장착 도립 광학 현미경 | Olympus Corporation | Olympus IX-51 | |
| 영구 희토류 자석 | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | |
| CCD 카메라 | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | |
| 시린지 펌프 | Harvard Apparatus | 11 Plus | 용액 교체를 용이하게 하기 위해 리필 모드로 작동함 |
| 파이버 일루미네이터 | Thorlabs Inc. | OSL1 |
참고문헌
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merril....
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