이 프로토콜은 KLRG1 리간드의 분석을위한 강력한 도구입니다 KLRG1 tetramer의 생산을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
킬러 세포 렉틴 같은 수용체 G1 (KLRG1)은 C 타입 렉틴 같은 superfamily에 속하는 유형 II의 transmembrane의 당단백질 수용체 억제합니다. KLRG1는 단량체로서 이황화 결합 homodimer로 모두 존재합니다. 이 잘 보존되어 수용체가 가장 성숙하고 최근에 활성화된 NK 세포에서뿐만 아니라 효과기 / 메모리 T 세포의 일부에서 발견됩니다.
KLRG1 tetramer뿐만 아니라 다른 방법을 사용하여, E -, N - 및 R - cadherins은 KLRG1 리간드로 확인되었습니다. 이러한 칼슘 2 +에 의존 세포 - 세포 부착 분자는 세포 - 세포 상호 작용, transmembrane 도메인과 굴지의 cytoskeleton에 연결된 세포질 도메인에 대해 책임을 다섯 cadherin의 반복을 포함하는 세포외 도메인에 구성되어 있습니다.
KLRG1 tetramer의 생성은 KLRG1 리간드의 식별에 필수되었습니다. KLRG1 tetramer 또한 면역 반응 및 조직 무결성을 규제의 역할 cadherin과 KLRG1 재생을 명료하게하다 수있는 유일한 도구입니다.
프로토콜
포함 기관의 준비
- TB 4 X 500 ML flasks의 예방 각각 KLRG1 플라스미드 구조를 표현하는 박테리아의 야간 문화와 50 μg / carbenicillin과 chloramphenicol의 ML을 포함. OD 600 nm의에서 0.6 A를 도달하면, 37에서 0.4 M IPTG의 추가와 함께 유도하고 떨고 추가 4 시간 동안 문화를 품어 ° C.
- resuspension 버퍼 산도에서 수확한 세포를 Resuspend = 8.0 (50 MM 트리스 - HCL, 25 % (W / V) 자당, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM DTT). 참고 : 알약이 단계에서 냉동 수 있습니다.
- 폴리 프로필렌의 비커에 세균성 resuspensions의 더 이상 60 이상 ML을 풀. 필요는 TE 버퍼 산도 8.0 60 ML에 적응 절반 속도로 혼합물을 저어하는 경우.
- 혼합물을 교반하려면 드롭 현명한 추가 라이 소 자임 (최종 = 1 MG / ML), MgCl2 (최종 = 5 ㎜), 2 MG DNAse 나는 50 % 글리세롤 75 MM NaCl, 트리톤 - X100 (최종 = 1 %), DTT를 (들어 최종 = 10 ㎜).
- 1.5 분 얼음 솔루션을 Sonicate 4에서 10 분, ....
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토론
이 프로토콜에서는, 그것은 biotinylate, 정화하는 방법을 표시하고, tetramerize KLRG1입니다. KLRG1 tetramer는 유동세포계측법로 KLRG1 리간드 레이블을 사용할 수 있습니다. refolding 조건이 각각의 단백질에 대해 경험적으로 테스트해야되지만, 다른 C - 타입 lectins은 유사한 프로토콜을 사용 tetramerized 수 있습니다. 프로브, 고아 C - 타입 렉틴 수용체에 리간드로 tetramerized 단백질을 사용하면 잠재적으로 식별 수 있습니다.
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감사의 글
우리는 refolding 조건을 최적화에 대한 도움 박사 Naidenko 감사합니다. 이 작품은 로랑 Brossay에 NIH 연구 부여 AI58181에 의해 지원되었다. 신디 반은 NIH NRSA F31 AI080230에 의해 지원됩니다.
스테파니 Terrizzi와 신디 반이 작품에 동등하게 기여하고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| BirA 효소 및 버퍼 | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | 시약 | Roche Group | 11 836 170 001 | 또는 동등 제품 |
| Amicon Stirred Cell | 장비 | EMD Millipore | Model #8400 | 또는 동등 제품 |
| YM10 NMWL 10K 초여과막 | 여과 소모품 | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 농축기 | 여과 소모품 | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | 장비 | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 고해상도 컬럼 | 장비 | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | 시약 | BD Biosciences | 554061 | 또는 동등 제품 |
참고문헌
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H.
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재인쇄 및 허가
