방법 논문

조직학, 조직 형태 측정 및 분석을위한 Fluorochrome Undecalcified 본 준비

DOI:

10.3791/1707

⸱

2010년 1월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Monash Immunology and Stem Cell Laboratories, Monash University, 2Anatomy and Developmental Biology, Monash University

이 논문에서

요약

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Undecalcified 뼈 조직학은 임상 및 연구 애플 리케이션의 다양한 중요 정보를 제공합니다. 그것은 기술적으로 특히 대형 표본과 도전이다. 이 동영상은 좋은 품질의 섹션을 제작하는 과정을 설명하고이를 극복하기 위해있는 기술적인 문제와 방법을 보여줍니다.

초록

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Undecalcified 뼈 조직학은 뼈의 마이크로 아키텍처를 보여줍니다. 그것은 뼈 회전율이나 뼈 형성과 재흡수에 대한 중요한 정보를 제공 뼈의 mineralized과 세포 구성 요소를 모두 보여줍니다. 이것은 임상 및 연구 애플 리케이션의 다양한 엄청난 중요성을했다. 그것은 아름다운 이미지 1을 산출 등 fluorochrome 평가 및 조직 형태 측정이 같은 기술을 허용합니다. Fluorochrome 분석 칼슘에 바인딩 형광 염료가 그 주어진 시간에 mineralization의 금액의 부량을 허용 특정 시점에서 주입하는 기술입니다. 조직 형태 측정은 현미경 수준에서 뼈 부량의 과정이다.

undecalcified 뼈 조직학을 수행하는 것은 기술적으로 특히 대형 표본과 도전이다. 그것은 조직학 임베디드 표준 파라핀에 사용되는 이들의 기술 변화가 필요합니다. 이 동영상은 좋은 품질의 섹션을 제작하는 과정을 설명하고이를 극복하기 위해있는 기술적인 문제와 방법을 보여줍니다. 표본 준비, 고정 및 처리는 종종 몇 주간 복용 밀도와 낮은 뼈의 투자율 상당히 긴 고정 및 처리 시간이 필요하기 때문에 그러나 다른 부드러운 조직과 유사한 방식으로, 함께 달성하고 있습니다. 퍼가기 그러한 메타 크릴 레이트 기반 수지로 뼛속까지 비슷하거나 동일한 경도와 밀도 지원 매체를 사용하여 달성하지만, 파라핀 침투와 포함 달리, 이것은 돌이킬 단계입니다. Sectioning 그러한 fluorochrome 분석과 같은 연구를위한 최적있는 두꺼운 섹션을 생산하는 연삭에 의해 얻을 수 있습니다. 이것은 가장 macrotome에 다이아몬드 블레이드를 사용하여 이루어진다. 또한, 얇은 부분은 빛을 현미경을 위해 생산 수 있으며 이것은 매우 날카로운 칼날과 슬레지 마이크로톰를 사용하여 이루어진다. 썰매 마이크로톰 큰 하드 블록에 필요한 추가적인 강도와 안정성을 제공합니다. 수지 포함된 섹션은 시연 아르 얼룩 다양한 물들일 수 있습니다.

프로토콜

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  1. 조직은 10 % 인산을 포함하는 밀봉된 컨테이너가 포르말린 용액 3 버퍼에 저장됩니다. fluorochrome 분석 fluorochromes가 빛을 구분으로 수행할 수있다면, 빛을 최소한의 노출을 보장합니다.
  2. 필요하게 될 조직의 어느 방향 수립.
  3. 크기로 시편을, 트림 올바른 방향으로, 밴드를 사용하여 보았다. 안전 보장 조치을 준수하고 있습니다. 표본은 다음 불투명 용기에 위치의 볼륨 충분한 고정을 달성하기 위해 약 10 배 정도 표본의 크기가되어야합니다. 표본은 포르말린 용액의 크기에 따라 한 사이에 두 주간의 총 유지됩니다. 이것은 테스트 및 최적화 목적으로 컨트롤 조직을 사용하여 제안합니다.
  4. 조직이 포함 금형에 맞는 선택하고 70 % 에탄올을 포함하고있는 밀폐된 불투명 용기에 조직을 놓으십시오.
  5. 빛과 지속적인 동요에 따라 차폐 에탄올의 농도를 오름차순으로 조직을 처리합니다.
    1. 70% 에탄올 일주
    2. 80% 에탄올 일주
    3. 90% 에탄올 일주
    4. 백퍼센트 에탄올 일주
  6. 조직은 다음에 다시 빛으로부터 지속적인 동요에 따라 차폐, 1 주일 butanol에서 지워집니다.
  7. 수지와 뼈 밀도가 밀접 수지 밀도가 (8 단계 참조) 변경할 수 있습니다. 일치하는 우리는 정확한 밀도를 보장하기 위해 먼저 테스트 표본을 포함하는 것이 좋습니다해야합니다. 우리는 가벼운 현미경과 fluorochrome 분석을위한 Technovit 7100 (Heraeus Kulzer)를 사용합니다. immunohistochemistry가 필요한 경우 대체 수지는 그러한 Technovit 9100 (Heraeus Kulzer)로 사용해야합니다.
  8. Technovit 7100 준비 솔루션이 필요 경우, 키트와 함께 제공되는 베이직 솔루션의 작은 aliquots와 혼합 수 있지만 더 이상 5 이상의 %를 준비 솔루션의 볼륨, 우리의 경험에 부드럽게 솔루션은 거의 필요하지 않습니다. 절대 에탄올과 기본 액체 Technovit 7100 동등한 부분은 빛의 노출을 최소화 24 시간 동안 미리 침투 솔루션으로와 교반과 혼합하여 조직에 적용됩니다.
  9. 침투 솔루션은 다음 100 ML베이스 액체에 녹아있다 1g의 경화제 I을 (= 1 봉지)를 사용하여 구성되어 있습니다. 이것은 미리 침투 솔루션을 대체하고 지속적인 교반에 따라 1 주일 침투 수 있습니다.
  10. 아래로 절단 표면 얼굴, 금형에 조직을 놓으십시오. 수지에 대한 조직 주위에 여백이 (이상 최소한 5mm)가 있는지 확인합니다, 이것은 블록의 강도를 보장합니다. 경화제 II 1 ML과 Technovit 7100 준비 솔루션의 15mls을 혼합하여 몰드에 시료 주위에 기름을 붓고 적어도 5 millimietres하여 커버. 경화 2 시간 이내에 시작되지만 밤새 완료됩니다.
  11. 장착은 다음 Technovit 3040 (Heraeus Kulzer)을 사용하여 백업 블록을 도운하여 수행됩니다. 가루 한 부분 액체에 점성 액체를 얻는 2 부분의 볼륨 비율 Technovit 3040를 섞습니다. 블록의 기지 위에서 최소한 2 mm의 수준으로 블록의 뒷면에있는 쉬는 시간에 Technovit 3040 하거라. 약 10 분 후 금형이 떨어져 벗겨와 블록이 준비하실 수 있습니다.
  12. 밀도 따라서 메타 크릴 레이트 수지의 절단 속성은 방에있는 주위 습도에 취약합니다. 블록 따라서 dessicator에 보관해야합니다.
  13. 그라운드 sectioning는 두께 20-50 micrometres 사이의 큰 부분을 생산하고 있습니다. 두꺼운 섹션 밝은 형광을 생산로 (아래 부분을 참조) fluorochrome 분석에 유용합니다. macrotome에 다이아몬드 블레이드를 고정합니다. macrotome에있는 저수지 이러한 석유 정신으로 윤활유를 추가합니다. 클램프의 블록을 안전하고 블레이드에 동쪽을 향하게하다. 적절한 윤활을 보장 (섹션 약 20~30분) 천천히 발생하는 연삭 수 있습니다. 첫 번째 섹션은 절단 얼굴을 노출하고 섹션이 - 그것이 폐기되어야 orientates.
  14. 다음 섹션은 다음 Superfrost 플러스 슬라이드에 배치됩니다. 섹션은 우리가 위에 샌드위치 가방의 일부를 삽입하여 다른 슬라이드 장소에 고정되어와 함께 그것이 평면 유지하는 것이 좋습니다 때문에 침묵하는 경향이 있습니다. 그 다음 1 시간 동안 섭씨 60-80도 사이의 인큐베이터로 배치됩니다. 이것은 메타 크릴 레이트를 부드럽게하고 섹션 평면 방식으로 슬라이드를 준수하는 데 도움이됩니다.
  15. 부드러운 방식으로 미세 그릿 샌드페이퍼를 사용하여 필요에 따라 지상 부분은 세척 및 연마 수 있습니다.
  16. 슬레지 마이크로톰는 얇은 섹션을 삭감하는 빛의 microsocopy위한 최상의 섹션을 제공합니다. 그것이 하드 블록을 절삭에 필요한 강성을 추가했습니다 같은 슬레지 마이크로톰을 사용합니다. 또는 전원 로타리 마이크로톰 사용할 수 있습니다. 날카로운 스테인레스 스틸 칼날을 사용합니다. 그것은 하나가 사용하는 다른처럼 날카롭게 수 있듯이 두 가지 블레이드를 가질 것이 바람직합니다. 블레이드는 블록과 45도 각도를해야합니다. 스rface의 연화가 필요한 경우 블록에 젖은 종이를 적용하여 얻을 수 있습니다. 그것은 품질 섹션을 얻기 위해 원하는 절삭 조건을 달성하기 위해 여러 섹션을 걸릴 수 있습니다. 섹션 다음 물을 욕조에 떠올 랐 이상 16으로 슬라이드에 배치됩니다.
  17. 얼룩의 시약은 다음과 재료에 나열되어 있습니다. 프로토콜은 밴크로프트 외 4를 기반으로합니다. 때문에 두께 변화에 그것은 테스트 슬라이드에 얼룩을 최적화하는 것이 좋습니다. 랙 얼룩은 조직이 필요할 수 있습니다 평면 슬라이드에 직접 얼룩을 추가 있도록 슬라이드를 플로트가 발생할 수 있습니다. 동일한 프로토콜 또는 랙 얼룩은 조직 형태 측정에 필요한 지속적인 얼룩의 결과를 위해 필요합니다.
    1. Haematoxylin과 Eosin
      1. Haematoxyilin 5~10분와 스테인
      2. 스콧의 수돗물로 잘 씻으십시오
      3. Eosin 오분와 스테인
      4. 수돗물에 세척
      5. 크실렌에 지우기
      6. 마운트
      7. 검색 결과
        1. 뼈 같은 = 핑크
        2. Calcified 뼈 = 보라색 갈색
        3. 핵 = 파란색
    2. 본 K​​ossa
      1. 실버 질산 용액에 플레이스와 mineralized 뼈가 검은 전환까지 강한 빛에 노출 (약 10 분)
      2. 증류수로 세 번 씻어
      3. 5 분 나트륨 thiosulfate와 위협
      4. 증류수로 세척
      5. Safrinin O와 Counterstain
      6. 크실렌에 지우기
      7. 마운트
      8. 검색 결과
        1. Mineralised 뼈를 = 검은색
        2. 뼈 같은 = 레드 / 핑크
    3. 메이슨 골드너 S Trichrome
      1. (80 % 에탄올의 90mls 20 분 25 % 암모니아 10mls) 알칼리성 알코올로 세척
      2. 물에 린스
      3. 증류수로 씻어
      4. 10 분 Weigert의 Haematoxylin와 스테인
      5. 증류수로 씻어
      6. 개양귀비빛의 - Fuchsin 최종 솔루션 오분와 스테인
      7. 1퍼센트 초산과 함께 15 초 린스
      8. phosphomolybdic 산성 - 오렌지 G 솔루션 5 분 스테인
      9. 1퍼센트 초산과 함께 15 초 린스
      10. 밝은 녹색 오분와 스테인
      11. 1퍼센트 초산 3 변경 린스
      12. 증류수로 씻어
      13. 마운트
      14. 검색 결과
        1. Mineralised 뼈를 = 녹색
        2. 뼈 같은 = 레드 / 오렌지
        3. 핵 = 블루 그레이
        4. 연골 = 보라색
  18. Fluorochrome 준비 :
  19. 이들은 최소 2 주 간격, 천천히 정맥 주사에​​ 의해 관리됩니다.
  20. 복용
    1. Calcein 그린 10 MG / kg IV
    2. Oxytetracycline 50 MG / kg IV
    3. 알리 자린 Complexone 30 MG / kg IV
  21. Calcein 그린의 준비
    1. 녹아까지 Calcein 그린 중 하나 그램은 1 M NaOH와 titrated 있습니다.
    2. 산도는 산도 = 7.1-7.2까지 1% NaOH로 조정됩니다.
    3. 필터와 빛으로부터 격리 보관
  22. 알리 자린 Complexone의 준비
    1. 녹아까지 알리 자린 complexone 세 그램은 1 M NaOH와 titrated 있습니다.
    2. 산도는 다음 산도 = 7.1-7.2까지 1퍼센트 HCL 또는 NaOH로 조정됩니다.
    3. 필터와 빛으로부터 격리 보관
  23. Oxytetracycline의 준비
    1. Oxytetracycline은 선반에서 안티 - 미생물의 약물로 사용할 수 있습니다. 아무 준비도 필요하지 않습니다.

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감사의 글

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저자는 그녀의 실험실 전문 수지 퍼가기와 MS Stephania 무덤에 그녀 전문 숄 수 코넬의 도움을 인정하고 싶습니다. 저자는 자신의 조언을 교수 프랭크 Kandziora 및 박사 마리 앤 Polboth 감사하고 싶습니다.

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재료

용매 :

  • 일반 10 % 포르말린, 에탄올, 크실렌 및 Butanol 산성을 버퍼
    모든 조직학 등급, 유황 무료입니다.
    Grale 과학 PTY 주식 회사
    http://www.grale.com.au
마울즈 :
  • 멀리 껍질, 플라스틱 금형
    Grale 과학
슬라이드 : 수지 : 얼룩
(Grale 과학에서 시약)

골드너의 Trichrome는 얼룩

1. Weigert의 철 hemotoxylin (DeGroat)

A) Hemotoxylin 솔루션
Hemotoxylin 1g
절대 알콜 100mL
B) 이런 솔루션
30% 수성 산화철 염화물 4mL
염산 (집중) 1mL
증류수 95mL

필터링과 같은 hemotoxylin의 볼륨을 바로 전에 얼룩은 사용에 추가됩니다.

2. 개양귀비빛의 - fuchsin - azophloxin 주식 솔루션

A) 개양귀비빛의 드 xylidine 솔루션
개양귀비빛의 데 xylidine 0.75g
산성 fuchsion 0.25g
아세트산 1mL
믹스, 그리고 추가 증류수 (100mL)
B) azophloxin 솔루션
Azophloxin 0.5g
초산 0.6mL
믹스, 그리고 추가 증류수 (100mL)
C) 최종 얼룩 솔루션을 작동
개양귀비빛의 - fuchsin 솔루션 5 - 10mL
Azophloxin 2mL
0.2 % 초산 용액 88mL

3. 라이트 그린 솔루션

연두빛 1g
초산 1mL
믹스, 그리고 증류수를 (500mL) 추가

4. Phophomolybdic 산성 - 오렌지 G 솔루션

Phosphomolybdic 수 소산 3g
오렌지 G 2g
증류수 500mL에 용해의와 크리스탈 티몰를 추가합니다.

본 K​​ossa는 스테인

1퍼센트 수성 실버 질산
2.5 %의 나트륨 thiosulfate
1퍼센트 safranin O

Alcian 파란색 얼룩

Alcian 블루 8GX 1g
3퍼센트 아세트산 용액 100mL

Hemotoxylin과 Eosin는 얼룩

A) 해리스의 hemotoxylin
Hemotoxylin 2.5G
절대 알코올 25mL
칼륨 알룸 50g
증류수 500mL
mercuric 산화물 1.25g OR
나트륨 iodate 0.5g
빙초산 20mL
B) Eosin 솔루션
상업 생산 Eosin가 사용되었습니다.

모든 얼룩 염색의 분말은 귀르 염료 분말입니다.
모든 시약은 분석 시약, 그리고하지 랩 시약

Fluorochromes


제조 업체 		Fluorochrome 카탈로그 번호
시그마 - 알드리치, 시드니 Calcein 그린 C0875
시그마 - 알드리치, 시드니 알리 자린 Complexone A3882
인터 베트 오스트 레일 리아, 빅토리아 Oxytetracycline
(선반 항균 약물 할인) 		Tradename; Engemycin 100

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kerr, J. Atlas of Functional Histology. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).
  2. Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).
  3. An, Y. H., Martin, K. l Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Humana Press Inc. New Jersey, USA. (2003).
  4. Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingston. Nottingham, United Kingdom. 352-360 (2008).

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