우리는 발달 규제 유전자의 잠재적인 확장기 요소를 찾아서 모자이크 zebrafish의 transgenesis 통해 기능을 평가하기 위해 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
많은 다른 종류의와 함께 인간 게놈 순서의 완성, 비 코딩 시퀀스에 특정 기능을 ascribing의 도전을 강조했다. 게놈의 비 코딩 분율에 의해 실시 하나의 두드러진 기능은 유전자 전사를 조절하는 것입니다,하지만, 널리 기본 DNA 시퀀스에서 CIS - 규제 요소를 예측하는 더 효과적인 방법은 없습니다. 우리는 기능 zebrafish transgenesis을 통해 잠재적인 CIS - 규제 요소를 평가하는 효율적인 프로토콜을 개발했습니다. 그것은 공간과 시간적 유전자 조절에 대한 정보를 제공 이후 우리의 접근 방식은, 발달 중요한 유전자에 대한 세포 문화 기반 기술에 비해 상당한 장점을 제공합니다. 반대로, 그것은 빠르고 저렴 유전자 변형 생쥐와 비슷한 실험보다, 우리는 정기적으로 인간 게놈으로부터 격리 시퀀스 프로그램을 적용해야합니다. 여기 복제 시퀀스에 대한 시퀀스 보호 및 프로토콜에 기초하고 zebrafish 배아에 그들을 microinjecting 테스트를위한 요소를 선택하기 위해 방법을 보여줍니다.
프로토콜
1. 선택하고 테스트하기위한 보존 시퀀스의 클로닝
- 하나는 첫번째 기능 테스트를 위해 잠재적인 규제 시퀀스를 식별해야합니다. 우리는 순서를 선택하는 기준으로 진화 순서 보존에 의존하고, 가장 많이 UCSC 게놈 브라우저 (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)에 트랙으로 액세스할 수있는 알고리즘 PhastCons를 사용합니다. 그러나, 수종에 걸쳐 순서 절약을 평가하기 위해 사용할 수있는 여러 가지 다른 알고리즘이 있습니다.
- 일단 우리가 우리의 시퀀스를 선택, 우리는 게놈 DNA에서 각 순서를 증폭하기 위해 primers를 디자인. Primers는 양쪽에있는 보존 지역 플러스 30 개 이상의 기본 쌍을 증폭하기 위해 선택되어야합니다.
- 선택된 시퀀스의 증폭을 위해 우리는 다카라 LA TaqTM 시스템을 사용합니다. 기타 polymerases가 작동하지만, 그것은 증폭 동안 소개 오류의 가능성을 최소화하기 위해, 교정 기능이있는 효소를 포함하는 혼합을 사용하는 것이 중요합니다. 우리는 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 amplicon의 크기를 확인합니다.
- 우리는 PCR 8/GW/TOPO TA 복제 키트 (Invitrogen)가 게이트웨이 항목 클론을 생성, attL 재조합 사이트를 포....
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토론
우리는 zebrafish transgenesis를 사용하여 잠재적인 그때의 효율적인 분석을 위해 저희 실험실에서 사용되는 접근 방식을 증명하고있다. 대부분의 자주, 우리는 인간의 유전자와 연관된 조직 고유의 강화를 찾는이 방법을 사용합니다. 명백한 순서 상동의 부족에도 불구하고 인간과 물고기가 아닌 코딩 순서를, 우리가이 접근 방식이 우리에게 관심의 유전자에 대한 강화를 식별 보통 성공 것을 발견했습니다. 사이에 대부분의 시간 성공을위한 중요한 요인은 플라스미드 DNA와 RNA transposase의 준비를 돌봐하고, 주입 각 구조에 대한 태아의 충분한 숫자를 검토하고 있습니다. transgene 건설, 배아 microinjections 및 모자이크 표현 분석의 일반적인 방법은 많은 다른 목적을위한 유전자 변형 zebrafish 라인을 생성하기 위해 적용됩니다.
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감사의 글
우리는 pDB600 플라스미드의 종류 선물 우수한 수산 축산에 대한 양 폴라 로이, 그리고 스티브 Ekker 감사드립니다. 이러한 연구 NHGRI에서 SF에 부여로 투자했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | |
| pCR8/GW/TOPO TA 클로닝 키트 | Invitrogen | K2500-20 | |
| Gateway LR Clonase II 효소 믹스 | Invitrogen | 11791-100 | |
| 라이브러리 효율 컴피턴트 셀 DH5α | Invitrogen | 12535-019 | |
| 라이브러리 효율 컴피턴트 셀 DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | |
| mMESSAGE mMACHINE 키트 | Ambion | AM1340 | |
| HiSpeed 플라스미드 Midi 키트 | Qiagen | 12643 | |
| QIAquick PCR 정제 키트 | Qiagen | 28104 | |
| Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 공압식 PicoPump | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 |
참고문헌
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for ....
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재인쇄 및 허가
