향상제 시퀀스를 평가하기위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

1. 선택하고 테스트하기위한 보존 시퀀스의 클로닝

1. 하나는 첫번째 기능 테스트를 위해 잠재적인 규제 시퀀스를 식별해야합니다. 우리는 순서를 선택하는 기준으로 진화 순서 보존에 의존하고, 가장 많이 UCSC 게놈 브라우저 (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)에 트랙으로 액세스할 수있는 알고리즘 PhastCons를 사용합니다. 그러나, 수종에 걸쳐 순서 절약을 평가하기 위해 사용할 수있는 여러 가지 다른 알고리즘이 있습니다.
2. 일단 우리가 우리의 시퀀스를 선택, 우리는 게놈 DNA에서 각 순서를 증폭하기 위해 primers를 디자인. Primers는 양쪽에있는 보존 지역 플러스 30 개 이상의 기본 쌍을 증폭하기 위해 선택되어야합니다.
3. 선택된 시퀀스의 증폭을 위해 우리는 다카라 LA TaqTM 시스템을 사용합니다. 기타 polymerases가 작동하지만, 그것은 증폭 동안 소개 오류의 가능성을 최소화하기 위해, 교정 기능이있는 효소를 포함하는 혼합을 사​​용하는 것이 중요합니다. 우리는 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 amplicon의 크기를 확인합니다.
4. 우리는 PCR 8/GW/TOPO TA 복제 키트 (Invitrogen)가 게이트웨이 항목 클론을 생성, attL 재조합 사이트를 포함하는 입력 벡터로 PCR 제품을 복제하기 위해 사용합니다. 복제 반응은 신선한 PCR 제품과 함께보다 효율적이기 때문에 PCR의 하루 이내에 복제를 수행하는 것이 최선입니다. DH5α의 변종의 변환은 spectinomycin 저항 선택에 의해 다음이 수행됩니다.
5. 우리는 삽입을 공개 EcoRI과 플라스미드의 ~ 500ng의 소화에 의해 TA 복제의 제품을 확인하고, 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 삽입의 크기를 확인합니다. 우리는 삽입 순서와 방향을 확인하는 순서 권장, 증폭에 사용된 primers는 시퀀싱을 위해 사용할 수 있습니다.
6. 항목 복제에서 비 코딩 보존 시퀀스는 게이트웨이 LR Clonase II 효소 믹스 (Invitrogen)를 사용하여 우리의 게이트웨이 준비 대상 벡터, pGW_cfosGFP1에 LR의 재조합에 의해 shuttled 있습니다. DH5α의 변종의 변환은 암피실린 저항의 선택에 의해 다음이 수행됩니다.
7. 우리는 삽입을 공개 EcoRV와 플라스미드의 ~ 500ng의 소화에 의해 LR 재조합의 제품을 확인하고, 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 삽입의 크기를 확인합니다. 정확한 복제가 확인되면, 우리는 Qiagen HiSpeed​​를 사용하여 플라스미드 DNA 플라스미드 ® 미디 키트를 준비합니다. 우리는 더 이상 제조 업체의 프로토콜에 의하면, QIAquick PCR의 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 정화, 30 μL RNase 무료 물로 DNA를 elute. 플라스미드는 μL / NG와 4에 저장된는 ° C 이전에 주사 125의 농도로 희석합니다.
8. RNA 인코딩 기능 Tol2 transposase 효소는 pDB600 plasmid2에서 체외에서 베꼈는데 있습니다. 우리는 Qiagen 미디 준비 키트를 사용하여 플라스미드를 정화하고 XbaI와 10-20 μg을 linearize. mRNA 합성이 mMESSAGE mMACHINE 키트 프로토콜 (앰비온) 다음과 같은 수행됩니다.
9. 우리는 정화 및 키트 지침에 따라 RNA를 침전. 우리는 RNase 무료로 물 속에, 마지막 ~ 1μg/μl의 농도, 또는 하나의 반응 20 μl로 RNA를 resuspend하고, UV 분광 광도법으로 정량. 우리는 또한 전체 길이 전송을 확인하는 아가로 오스 겔 전기 영동으로 RNA의 ~ 1μg을 분석. 표준 태 또는 TBE 젤이 분석에 적합하지만, 전사 키트에 포함되어있는 denaturing 샘플 버퍼 키트의 지시에 따라 사용해야합니다.
10. 우리는 알려진 플라스미드 (그림 1)과 주사를 수행하여 효험에 대한 transposase RNA의 각각의 새로운 배치를 테스트합니다. 확인 후, RNA는 작은 aliquots로 나뉘어 있으며, -80 ° C에서 저장, 반복 해동 및 개인 aliquots의 refreezing을 피할 수 있습니다.
    
    그림 1. Zebrafish의 배아는 제어할 수 있습니다. (위) 브라이트 이미지 (아래) GFP 형광 이미지로 마우스 Sox10 확장기로 주입. transposase RNA의 각 새로운 배치는 효능에 대해 테스트됩니다.

2. 모자이크 유전자 변형 분석을 위해 zebrafish 배아의 Microinjection

1. 우리는 그대로 chorions을 뚫을 상당히 날카로운 테이퍼와 강력한 팁을 얻을 수 있도록 설계된 프로그램, 셔터 P - 97 Micropipette의 풀러에서 1.2 mm OD 필라멘트 모세관 유리 microinjection을 위해 바늘을 가져옵니다. 우리는 깨끗한 면도날와 마이크로 미터의 슬라이드를 사용하여 약 15 μm의의 외경에 stereomicroscope 아래 손으로 팁을 휴식. 바늘은 주사 전날했고, 깨끗하게 유지하는 대상 지주 접시에 저장할 수 있습니다.
2. 우리는 표준 conditions3 아래 빛을 14 시간과 함께, 일반 조명 어두운주기에 우리의 zebrafish를 유지합니다. 일 이전에 수행 microinjections에, 우리는 작은 사육 탱크, 기본 탱크로 구성된 각 홈 붙이 삽입 및 플라스틱 뚜껑에 초과 matings을위한 물고기를 설정합니다. 우리는 세 여성 또는 t 당 두 남자를 배치병렬 행을 ank.
3. microinjections 아침에 빛을주기가 시작 직후, 우리는 계란 생산의 클린 시스템 처리 물에서 남성과 여성을 결합 시작합니다. 자주 생선을 확인하고, 부설의 몇 분 이내에 달걀을 수집, 잘 동기 배치를 얻을 것이 중요합니다. 계란 생산은 아침 내내 신선한 물고기의 그룹을 결합하기 위해 계속하여 2 ~ 세 시간 동안 유지하실 수 있습니다.
4. 넓은 구멍으로 5 1 / 4 "유리 파스퇴르 피펫은 라텍스 전구가 장착되어, 우리가 50 배아의 그룹 부분 엠브료 Medium2 가득 60 X 15mm 페트리 요리,에 수집된 배아를 정렬하고, 마르크 시간에 수집 각 접시의 뚜껑.
5. 물고기가 누워 시작되면, 우리는 얼음에 microfuge 튜브에 다음을 혼합하여 신선한 사출 솔루션을 준비 :

   구성 요소
   Transposon 플라스미드 주식 (125ng/μl)	1μl
   Transposase RNA 주식 (175ng/μl)	1μl
   페놀 레드 주식 (H 2 O 2 %)	0.5μl
   RNase 무료로 물	2.5μl

   
   주사 바늘은 요리를 들고서도 잠자리 각 바늘의 광범위한 엔드에 주입 용액 500 NL의 방울을 pipetting으로 채워지게된다. 액체가 모세관을 통해 끝부분에 그림이 그려진 후에, 추가적인 솔루션은 1.5-2 μl 총 추가할 수 있습니다. 우리는 각 주사 솔루션을위한 최소한 두 바늘을 준비합니다.
6. 가득 바늘이 손에 구성하고 제조 업체의 지침에 따라 N2 탱크에 연결된 공압 피코 - 펌프 또는 유사 압력 주입기의 바늘 홀더 개최에로드됩니다. 우리는 마이크로 미터의 슬라이드에 광유로 퇴학 처분 방울의 직경을 측정하여 사출 볼륨을 보정합니다. 일반적으로 20 PSI의 압력으로 120 MS의 주입 시간은 약 1 NL의 비말을 낼 수 있지만, 바늘 직경 약간의 차이는 이러한 매개 변수에 영향을 미칠 것이며, recalibration가 바늘 사이에 필요할 수 있습니다.
7. 주사는 6 - 10X 배율에서 stereomicroscope에 따라 수행됩니다. 우리는 장소에 배아를 보유 chorion 통해 한 셀 또는 셀이 초기 단계에서 배아의 노른자에 지속적인 압력으로 주입 바늘을 밀어 벌금 포셉 한 쌍의을 사용합니다. 이상적으로, 우리는 그냥 blastomeres 아래의 노른자에서 바늘 끝의 위치. 사출 솔루션의 약 1 NL 퇴학과 바늘이 철회됩니다. 각각은 우리가 ≥ 200 배아를 주입 구축하십시오. 그것은 uninjected 제어 배아의 요리를 저장, 수집 태아의 각 클러치에 대해, 또한 매우 중요합니다.
8. 주사가 완료되면 우리는 unfertilized 계란, 손상된 배아, 그리고 실패 주사 (blastomeres에 없음 페놀 레드 배아) 제거하여 배아를 정렬하십시오. 그러면 ° C 적절한 시간까지 관찰을위한 28.5에서 배아 매체에서 배아를 품어.

3. 모자이크 표현 패턴 분석

1. 적절한 배양 시간에 따라, 우리는 형광에 대한 주입 배아를 검사하십시오. 타이밍은 내생 zebrafish의 유전자의 정상적인 표현 패턴에 따라 다르지만, 우리는 보통 처음 5 일간 게시물 수정을 통해 매일 봐요.
2. 우리는 epifluorescence에 대한 장착 올림푸스 MVX10의 macroscope에서 형광을위한 배아를 검사하지만, 낮은 전력 이미징 가능한 모든 유사한 현미경 작동합니다. 사망 또는 첫날에 비정상적으로 개발한 배아들 중 다수가있다면, 그들이 정상으로 보이는지되는 클러치에 대한 uninjected 컨트롤보세요. 컨트롤 정상 보면, 가장 일반적인 문제는 주입된 DNA의 순도 부족한 것입니다. 또한, 초기 단계의 배아는 주입 플라스미드의 총 금액을 구분하므로 그것은 부량가 부정확했고 너무 많은 DNA가 주입되었다 수도 있습니다.
3. 배아를 검사하면, 그들은 모두 주입 구조에 대한 모자이크 될 것을 명심하십시오. 그것은 표현의 예상 도메인이 작고 특히 경우, 태아의 전혀주의 깊게 볼 필요합니다. 또한 표현이 동적 될 수 있다고 기억, 1 일에 대한 강한 형광 하루에 2와 표현에 대해 처음 3 일 4 일 뭔가를 보여주고 있습니다 부정적인 태아로 사라진다 수 있습니다.
4. 우리는보다 광범위한 표현을 몇 가지 배아를 선택하고, photomicroscopy에 의해 형광의 패턴을 문서에 다음을 사용합니다. 관찰 5 일 후 배아가 시설에 반환되어야하며 주식으로 키웠습니다. 몇 개월에서, 성인은 transgenes의 germline 전송에 대한 검사를하실 수 있습니다.

4. 검색 결과

우리는 넓은 V를 참조하십시오분석중인 향상제 요소에 따라 패턴과 표현의 수준 ariety. 우리는 일반적으로 매우 구체적인 조직 표현 패턴에 관심이 있으며, 종종 골격 표현 유전자에 초점을 맞추고 있습니다. 그리고 종종 골격 표현 유전자에 초점을 맞추고 있습니다. 그림 2는 연골과 뼈의 표현을 규제 강화와 함께 우리가 주입된 배아에서 관찰이 모자이크 표현 패턴의 예제를 보여줍니다. 마지막으로, 테스트 시퀀스의 상당한 부분은 조직 구체적인 표현을 규제하지 않습니다. 이러한 경우, 우리는 대부분 거의 형광, 배아 당 아마도 몇 흩어져있는 세포를 참조하십시오. 적게, 우리는 오직 이소성 표현, 표피 및 골격 근육 (그림 3)의 두 가지 일반적인 사이트에, 형광 볼 수 있습니다.

그림 2. 주입 배아에서 관찰 연골과 뼈 표현 패턴의 예.

그림 3. 유전자와 표현의 규정에 향상제의 상대의 위치 사이에 약간의 상관 관계가있다. 테스트 시퀀스의 상당한 부분은 조직 구체적인 표현을 규제하지 않습니다. 이들은 종종 거의 형광을 가지고, 또는 이소성 표현 두 가지 일반적인 사이트에있을 수 있습니다 : 표피와 골격 근육. (위) 브라이트 이미지 (아래) GFP 형광 이미지.

We have demonstrated the approach used in our laboratory for the efficient analysis of potential enhancers using zebrafish transgenesis. Most often, we use this approach to look for tissue-specific enhancers associated with human genes. Despite the lack of obvious sequence homology most of the time between human and fish non-coding sequences, we find that this approach is usually successful in identifying enhancers for the genes of interest to us. The critical factors for success are taking care in the preparation of the plasmid DNA and the transposase RNA, and injecting and examining a sufficient number of embryos for each construct. The general methods of transgene construction, embryo microinjections, and mosaic expression analysis would be applicable to generating transgenic zebrafish lines for many other purposes.