우리는 총뿐만 아니라 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 CD4 +와 CD8 + T 세포, HIV / AIDS 백신 연구를위한 이상적인 모델의 메모리 하위 집합에 대한 자세한 phenotypic와 기능 특성에 대한 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 유틸리티를 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이 모델은 현재 백신 및 치료제의 개발을위한 최상의 사용할 수있는 pathogenesis을 이해와 관련하여 HIV - AIDS에 대한 모델뿐 아니라
프로토콜
1) 셀 준비와 antigenic의 자극, 2) 표면 마커 얼룩, 3) 세포 시토킨 얼룩과 4) 유동세포계측법 : 총뿐만 아니라 T 세포의 메모리 하위 집합의 세부 phenotypic 및 기능 분석에 대한 절차는 네 부분으로 나눌 수 분석합니다.
1. 세포 준비와 antigenic의 자극
- 두 신선하게 격리뿐만 아니라 cryo 보존된 말초혈 mononuclear 세포 (PBMC)가이 프로토콜에 사용되었습니다. PBMC는 Ficoll - Hypaque (Histopaquen - 1077, 시그마 - 알드리치, ST. 루이스, MO)를 사용하여 밀도 기울기 침강에 의해 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 heparinized 또는 citrated 정맥의 혈액 샘플로부터 격리되었다. PBMC의 Aliquots는 90% FCS에 냉동 저장 및 액체 질소의 10 % DMSO되었습니다.
- cryo - 보존된 PBMC를 사용하는 경우, 냉동 PBMC의 유리병은 액체 질소에서 제거되었으며 신속하게 냉동 매체와를 제거하는 RPMI - 1640 (HyClone 실험실, 로건, UT)로 씻어, 부드럽게 혼합, 37 C의 물을 욕조에 해동 전체 미디어 다시 정지 [CM, 10 %로 RPMI - 1640 보충 열 inactivat....
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감사의 글
짧은 꼬리 원숭이 혈액과 PBMC 샘플 박사 프라 모드 Nehete 부부 바티 Nehete,이 작품은 부분적으로 NIH 부여 AI 46,969의 자금에 의해 지원되었고, 모든 세포 배양 매체는 중앙 미디어 연구소에 의해 생산되었다, NIH 부여 CA에 의해 자금 지원됩니다 16672.
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재료
솔루션 및 버퍼
- Ficoll - Hypaque (Histopaquen - 1077, 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO)
- RPMI - 1640 배지 (HyClone 실험실, 로건, UT)
- 태아 소 혈청 (FBS), (HyClone 실험실, 로건, UT)
- L - 글루타민 (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO)
- 페니실린은 / 스트렙토 마이신 (Invitrogen, 칼스 배드, CA)
- Trypan 파란색 시약 (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO)
- 50 MM 트리스, PH 8.6, 4 필터링과 가게 ° C
- Dulbecco의 PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free, 생명 기술, 락빌, MD)
- 흐름 세척 버퍼 : 2% FBS와 DPBS 보완, 4 저장 ° C
- BD Cytofix / Cytoperm 고정 / Permeabilization 솔루션 키트 (BD Biosciences, 산호세, CA)
활성화 요원
- Phorbol 12 - myristate 13 - 아세테이트 (PMA) (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO)
- Ionomycin (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, 클론 9F10 (BD Biosciences, 산호세, CA)
- 친화력 정화 항체 F (AB) 염소 방지 마우스 IgG (H + L) 2 조각 (Kierkegaard 및 페리 연구소, 게이 더 스버그, MD)
- 특정 인증 요원들은 펩타이드 수영장, 단일 펩티드, 또는 전체 단백질을 포함시킬 수
시토킨 분비 억제제
- Brefedin A (BFA, 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO)
- 잠돌군 Zz 플러그는 (; 산호세, CA BD Biosciences) 또는 사용할 수 있습니다
항체
- 죽은 / 라이브 고칠수 아쿠아 형광 얼룩 키트 (Invitrogen, 칼스 배드, CA)
- 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy7 (SP34 - 2), (BD Biosciences, 산호세, CA)
- CD4 태평양 블루 (OKT4), (eBiosciences (샌디에고, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA - T8), (BD Biosciences, 산호세, CA)
- CD28 PerCP - cy5.5 (L293), (BD Biosciences, 산호세, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences, 산호세, CA)
- IFN - FITC (B27), (BD Biosciences, 산호세, CA)
- IL - 2 PE (MQ1 - 17H12), (BD Biosciences, 산호세, CA)
참고문헌
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Viru....
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