저자들은 공개할 사항이 없습니다.

크리스토퍼 휴즈 : angiogenesis 연구를위한 체외 모델 (인터뷰)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

크리스토퍼 CW 휴즈는 체외에서 angiogenesis 공부에 대한 자신의 문화 시스템의 유틸리티를 설명합니다. 그는 지점, 적절한 루멘을 형성하고, anastamosis를 받아야되는 내피 세포가 문화의 혈관 형성하도록 중요한, 아직 미확인, 용해 계수를 분비 섬유아 세포의 중요성을 설명합니다.

크리스토퍼 휴즈 : Angiogenesis 연구를위한 체외 모델 (인터뷰)

Christopher C.W. Hughes는 인비트로(in vitro) 혈관 신생 연구를 위한 본인의 배양 시스템의 유용성에 대해 설명합니다. 그는 ...하는 섬유아세포의 중요성에 대해 설명합니다.

안녕하세요, 저는 Christopher Hughes 박사입니다. 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 교수이며, 저희 연구실에서는 혈관 신생 연구를 수행하고 있습니다. 특히 저희는 혈관 신생 과정을 조절하는 유전자에 깊은 관심을 가지고 있습니다.본 연구진은 Nelson 등의 연구를 바탕으로 인비트로(in vitro) 분석법을 최적화하였으며, 이 분석법을 통해 혈관신생 과정 중에 일어나는 모든 다양한 프로세스를 관찰할 수 있습니다. 우선 내피세포가 부착된 작은 테덱스(tedex) 비드를 코팅합니다. 그런 다음 이를 피브린 겔(fibrin gels)에 매립합니다. 이후 성장 인자를 제공합니다.그리고 며칠에 걸쳐 내피세포가 비드로부터 발아합니다. 이 세포들은 이동하고, 정렬하며, 증식하고, 관을 형성하며, 분지하여 문합을 이룹니다. 따라서 약 10일이 지나면 배양 접시 내에 완전한 모세혈관 유사 네트워크가 형성됩니다.in vivo 혈관 신생 분석법, 예를 들어 마우스를 이용한 분석의 몇 가지 문제점은 시스템을 조작하기가 매우 어렵다는 것입니다. 동물 내부에서 이러한 과정이 진행될 때 이를 시각화하기 어렵기 때문에, 혈관 신생이 일어나는 모습을 실제로 관찰할 수 없습니다. 반면, in vitro 배양 시스템에서는 내피세포를 유전적으로 조작하여 유전자의 발현을 켜거나 끄는 것이 매우 쉬우며, 이를 통해 발아 혈관 신생(sprouting angiogenesis)에 미치는 영향을 살펴볼 수 있습니다.그리고 전신 동물 모델에서 이를 수행하는 것은 훨씬 더 어렵습니다. 녹아웃(knockout) 또는 녹인(knockin) 모델을 만들어야 하기 때문입니다. 따라서 이것이 두 가지 주요 장점입니다.조작이 쉽고 시각화하기 편리합니다. 따라서 수년 동안 다양한 인비트로(in vitro) 혈관 형성 분석법이 개발되었으며, 각각의 장단점이 있습니다. 특히 잘 알려진 방법 중 하나는 내피세포를 매트리젤(matrigel)이라고 불리는 세포 외 기질 위에 배치하는 매트리젤 분석법입니다.문제는 내피세포가 끈 형태의 구조를 만들기는 하지만, 제대로 된 내강이 형성된 혈관을 실제로 만들어내지 못한다는 점입니다. 발아나 문합 현상이 관찰되지 않습니다. 이에 반해 콜라겐 겔 모델이 유용한 대안이 될 수 있습니다.그러한 사례가 많이 있습니다. 내피세포의 증식이 관찰되지 않으며, 문합(anastomosis) 또한 잘 나타나지 않는 경향이 있습니다. 저희가 개발한 피브린 겔 분석법은 90년대 중반에 발표된 Nelson Kar의 모델을 기반으로 합니다.이제 우리는 혈관 신생의 모든 단계를 관찰할 수 있을 정도로 이를 획기적으로 개선했습니다. 초기 발아와 이동 과정을 관찰할 수 있으며, 세포 증식과 내강 형성을 확인하고, 분지 과정을 거쳐 최종적으로는 체외에서 완전한 혈관 네트워크를 형성하는 문합 단계까지 관찰할 수 있습니다.따라서 이 분석법은 혈관 신생의 모든 다양한 단계를 관찰하고자 할 때 현재 이용 가능한 가장 우수한 in vitro 시스템이라고 믿습니다. 이 in vitro 분석법의 또 다른 장점은 레이저 캡처 미세 절단(laser capture micro dissection)을 수행할 수 있다는 점인데, 배양물을 원심 분리하여 매우 평평하게 만든 다음 레이저 캡처 미세 절단 현미경을 사용할 수 있습니다. 이를 통해 실제 개별 세포를 추출할 수 있으며, 특히 우리는 팁 세포(tip cells)에 관심을 두고 있습니다.따라서 이를 절단하여 유전자 발현, 특히 팁 세포(tip cells)와 루멘을 실제로 형성하는 몸통 세포(trunk cells) 간의 차이를 살펴볼 수 있습니다. 우리의 가설은 이 두 세포 집단 사이에 차별적인 유전자 발현이 나타날 것이라는 점입니다. 우리는 이를 확인할 수 있으며, 이는 생체 내(in vivo) 시스템에서는 거의 불가능한 작업일 것입니다.따라서 우리는 이것이 이러한 in vitro 분석법을 사용하는 또 다른 주요 장점이라고 생각합니다. 제가 언급했듯이 Nelson Recon이 수행한 초기 연구에서는 미세혈관 내피세포를 사용했습니다. 생체 내(in vivo)에서 실제로 새로운 혈관을 형성하는 것은 미세혈관 내피세포이기 때문에, 이러한 분석법에는 미세혈관 내피세포를 사용하는 것이 적절하다는 견해가 많습니다.저희는 HUVEC을 사용하여 이를 시도하기로 했습니다. HUVEC은 인간 제대정맥 내피세포이며, 이를 선택한 몇 가지 이유 중 하나는 이 세포들을 매우 쉽게 얻을 수 있기 때문입니다.병원을 방문하여 분만실에서 탯줄을 얻을 수 있으며, 세포를 매우 쉽게 분리할 수 있습니다. 또한 이 세포들은 수년 동안 배양에 사용되어 왔으며, 특성이 매우 잘 규명되어 있습니다.따라서 우리는 이러한 이유로 해당 세포들을 사용할 수 있도록 이 분석법을 설정하고 최적화했습니다. 흥미롭게도, 이러한 대혈관 내피세포(large vessel endothelial cells)는 배양 시 미세혈관 내피세포(microvascular endothelial cells)의 형태를 띠는 것으로 나타났습니다. 이들은 일반적으로 대혈관 내피세포에서 발현되는 많은 유전자들을 소실하며, 일반적으로 미세혈관 내피세포와 관련된 유전자들을 발현하기 시작합니다.또한 이들은 배양 조건에서 모세혈관과 유사한 발아를 형성하고 루멘(lumen)을 만들어 실제 모세혈관과 똑같이 보이는 구조를 충분히 형성할 수 있습니다. 따라서 사용하기 쉽고 다루기 용이하며, 우리가 원하는 기능을 수행합니다. 즉, 발아하여 적절한 루멘이 형성된 혈관을 만들어냅니다.이 분석법을 정량화하려는 경우, 몇 가지 방법이 있습니다. 싹의 수, 싹의 길이, 싹의 직경, 분지점의 수, 문합의 수와 같은 정량적 기준을 살펴볼 수 있으며, 정성적 기준 또한 함께 살펴볼 수 있습니다. 예를 들어, 루멘(lumen)이 형성되고 있는지를 확인할 수 있습니다.그리고 그것이 아마도 우리가 가장 관심을 갖는 부분일 것입니다. 우리가 수행하는 많은 분석에서 중요한 점은 적절한 내강 형성이 이루어지는지 확인하는 것입니다. 이는 주로 정성적인 평가에 해당하지만, 혈관이 커짐에 따라 실제로는 해당 내강의 직경을 측정할 수도 있습니다.따라서 이러한 배양에는 섬유아세포를 사용합니다. 비드를 피브린 겔 내에 매립하고 겔 위에 섬유아세포를 분주합니다. 섬유아세포는 적절한 발아와 내강 형성에 절대적으로 필수적입니다.섬유아세포가 없는 경우에는 어느 정도의 발아(sprouting)가 일어납니다. 하지만 내피세포들은 서로 부착된 상태를 유지하지 못하는 경향이 있습니다. 즉, 세포들이 서로로부터 멀어지며 이동하게 됩니다.따라서 이 싹에서 발달하는 모든 구조는 붕괴되는 경향이 있습니다. 그리고 며칠 후, 혈관내피세포는 세포사멸을 겪게 됩니다. 결과적으로, 적어도 이 인비트로(in vitro) 시스템에서는 섬유아세포가 혈관신생에 필수적인 인자들을 생성하는 것으로 보입니다.저희는 이러한 요인들이 무엇인지 밝히는 데 매우 많은 관심을 기울여 왔습니다. 저희가 발견한 점은 섬유아세포(fibroblasts)가 배지로 무언가를 분비한다는 것이며, 따라서 섬유아세포의 조건 배지(conditioned medium)를 사용하면 적절한 발아(sprouting)와 내강(lumen) 형성을 지원할 수 있습니다. 즉, 저희는 확실히 수용성 인자(soluble factor)를 다루고 있는 것입니다.따라서 우리는 이 시스템의 혈관 신생에 매우 중요한 섬유아세포의 생성 물질이 무엇인지 확인하는 데 매우 큰 관심을 가지고 있습니다. 우리는 VEGF, basic FGF와 같은 일반적인 후보 물질들을 모두 시도해 보았으며, 이들은 배양액 내에 존재하지만 추가로 투여하더라도 섬유아세포를 대체하지 못했습니다. 또한 angiopoietin one, TGF beta, HGF 등을 모두 시도해 보았습니다.지금까지 핵심 인자를 발견하지 못했습니다. 그래서 현재는 섬유아세포의 배양 상층액(conditioned medium)에서 인자들을 정제하는 작업을 수행하고 있습니다. 배양 상층액을 양이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피 등 다양한 컬럼에 통과시켜 활성을 가진 분획들을 얻고 있습니다.이제 우리는 그 활성을 추적하며 분획들을 수집하고, 어떤 분획이 활성 상태인지 확인하고 있습니다. 그런 다음 이를 젤 전기영동으로 분석하여 젤 상에 밴드 수가 비교적 적게 나타나는지 확인한 후, 해당 밴드를 절단하여 질량 분석법(mass spec)으로 서열을 분석할 수 있습니다. 이를 통해 매우 흥미로운 데이터들을 많이 얻고 있습니다. 현재 우리는 개별적으로 테스트하여 우리가 찾고 있는 실제 인자인지 확인 중인 여러 후보 유전자들을 확보한 상태입니다.우리는 많은 알려진 혈관 형성 인자들을 테스트했으며, 이 분석법에서 적절한 발아(sprouting)를 위해서는 VEGF와 basic FGF가 실제로 필수적이라는 것을 알고 있습니다. 하지만 이것이 전부가 아닙니다. 앞서 언급했듯이 중요한 유도 인자들이 존재하며, 우리가 이를 확인한 방법 중 하나는 생체 내(in vivo)에서 강력한 혈관 형성 능력을 갖추어 마우스 내에서 크기가 큰 종양을 생성하고 혈관 분포가 매우 높은 종양 세포를 사용한 것이었습니다.우리는 이 종양 세포들을 살펴보았으며, 이들은 매우 높은 수준의 vegf를 발현하고 있어 이를 배양계에 넣었습니다. 즉, 섬유아세포를 이 종양 세포들로 대체하였는데, 이들은 이 분석법에서 강력한 혈관 신생을 지원하지 않았습니다. 이는 매우 흥미로운 결과입니다.이것이 시사하는 바는, 그리고 다른 연구자들에 의해 이미 제기된 바와 같이, 종양과 조직 내의 섬유아세포 및 기타 지지 세포를 포함하는 기질(stroma), 그리고 내피 세포 사이에 상호작용(crosstalk)이 있다는 것입니다. 종양 세포가 내피 세포에 직접 작용하는 인자를 생성할 수도 있지만, 섬유아세포 및 기타 기질 세포를 자극하여 활발한 혈관 신생(Angiogenesis)을 지원하는 인자를 만들게 하는 또 다른 인자들을 생성할 가능성도 충분히 있습니다.

christopher-hughes-an-vitro-model-for-study-angiogenesis

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

University of California, Irvine (UCI).  크리스토퍼 CW 휴즈는 체외에서 angiogenesis 공부에 대한 자신의 문화 시스템의 유틸리티를 설명합니다. 그는 지점, 적절한 루멘을 형성하고, anastamosis를 받아야되는 내피 세포가 문화의 혈관 형성하도록 중요한, 아직 미확인, 용해 계수를 분비 섬유아 세포의 중요성을 설명합니다.

크리스토퍼 휴즈 : Angiogenesis 연구를위한 체외 모델 (인터뷰)

이 논문에서

요약

초록

공개 사항

재인쇄 및 허가

태그