방법 논문

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

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DOI:

10.3791/1773

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2010년 5월 25일

 ,  ,  , 
1Molecular Biology of Neural Development, Institut de Recherches Cliniques de Montréal, 2Division of Experimental Medicine and Program in Neuroengineering, McGill University, 3Program in Neuroengineering, McGill University, 4Montreal Neurological Institute, 5Department of Anatomy and Cell Biology, McGill University, 6Department of Biology, McGill University, 7Department of Medicine, Universite de Montreal - University of Montreal

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 동영상은 E13 쥐 등의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 보여줍니다. Dissociated commissural 뉴런이 축삭의 성장과지도의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용합니다.

초록

Commissural 뉴런 널리 배아 척수 개발 중에 축삭의 가이드를 기본 메커니즘을 조사하는 데 사용되었습니다. 이러한 뉴런의 세포 기관은 등의 척수에 위치하고 axons은 배아 발달 동안 틀에 박힌 궤도를 따라하고 있습니다. Commissural axons 처음 floorplate 향해 ventrally 프로젝트. 정중선을 건너 후 다음 axons은 두뇌 향해 anteriorly 및 프로젝트 설정합니다. 이러한 각 단계는 여러지도 단서의 조치에 의해 규제됩니다. 높은 commissural 뉴런의 풍부한 문화가 이상적으로 돌리는 assays, immunochemistry 및 생화학을 포함하여 축삭의 pathfinding의 메커니즘을 주소 다양한 실험에 적합합니다. 여기, 우리는 E13 쥐 등의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 설명합니다. 첫째, 척수는 격리되고 지느러미 스트립이 밖으로 해부하고 있습니다. 등의 조직 trypsinization 및 기계적 방해하여 세포 현탁액에 다음 dissociated 있습니다. 뉴런은 폴리 - L - 라이신 - 코팅 유리 coverslips 또는 조직 문화 요리에 도금입니다. 30시간 후

프로토콜

1. 배아 쥐 등의 척수의 해부

일반 권장 사항

얼음 L - 15 중간을 유지하고 자주 배아는 냉각 유지하는 해부 접시에있는 매체를 변경합니다. 이것은 조직 무결성을 유지하는 데 도움이됩니다. 명시되지 않는 한 모든 단계 더몬트 # 5 포셉 두 쌍이있는 수행됩니다. 오염을 피하기 위해, 70 % 에탄올 모든 도구와 작업 표면을 스프레이하고 해부 매체 병 감아. 요리 사이의 배아를 전송하려면, 절단 플라스틱 피펫이나 천공 숟가락을 사용합니다. 그것은 성공적으로 절개를 완료하기 위해 척수를 (스트레칭, nicking) 손상하지 않는 것이 중요합니다.

준비

  • 콜드 L - 15 배지
  • L - 15의 50 ML + 10 %의 열 inactivated 말 혈청 (HiHS). 얼음 계속.

척수의 해부

  1. 안락사 E13 임신 - 공연 쥐 (E0 = 짝짓기 일 다음 첫 날) 기관 지침에 따라 CO 2 챔버와 함께.을
  2. 복부에 70 % 에탄올을 스프레이. 핀치, 외과 가위로 잘라 집게와 함께 낮은 복부의 피부를 당기십시오....

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토론

우리는 배아 쥐의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 설명합니다. 이 절차는 정기적으로 안정적으로 축삭지도의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 뉴런을 준비하기 위해 우리가 실험실에서 사용되고 있습니다. 세포 생물학 및 immunochemistry 실험 한 쓰레기의 해부에 충분한 신경을 생산하고 있습니다. 더 많은 세포가 필요로하는 경우 등 많은 생화학 실험, 두 새끼의 절개처럼이 필요할 수 있습니다. 훈련된 사람, 해부 및 ~ 20 배아의 분리는 이하의 4 시간 만에 수행할 수 있습니다. 긴 timescales는 조직 무결성의 변화로 인해 척추 코드보다 어려운 절개가 발생합니다, 또한 가능한 뉴런의 효율적인 복구를 손상하실 수 있습니다.

처음으로 절차를 수행하면, 비교를위한 다양한 PLL - 코팅 표면에 플레이트 세포 (산성 - 세탁 유리 coverslips, 조직 문화 요리). 일반적으로 세포는 PLL - 코팅 플라스틱 조직 문화 요리 또는 .......

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감사의 글

이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR), 피터 로히드 의학 연구 재단, Neuroengineering에있는 맥길 프로그램에서 교부금에 의해 지원되었다, 퐁 드 물리 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ), 그리고 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI ). 쎄바스띠앙 D. 랑그르와는 퐁에서 석사 훈련 수상에 의해 지원되었다 드 라 공들인 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ)과 프레드릭 밴팅와 찰스 건강 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에서 최고의 캐나다 대학원 장학금 석사 수상. 우리는 숫자와 함께 도움 제시카 MT 팸에 감사하고 있습니다.

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재료

배아 쥐 등의 척수의 해부 (표도 I 참조)

  • E13 쥐 임신 - 연출
  • 에탄올 70%
  • 외과 가위, 파인 과학 도구
  • 집게, 더몬트 # 5, 파인 과학 도구
  • 배양 접시
  • L - 15 배지
  • 해부 현미경, Leica
  • 플라스틱 전송 pipettes
  • Microscissors, 파인 과학 도구
  • 텅스텐 바늘과 핀 홀더 (한 후크 모양의 바늘 한 L - 모양의 바늘 한 바늘 직진), 파인 과학 도구
  • 열 inactivated 호스 세럼 (HiHS)
  • 15 ML 플라스틱 튜브

Commissural 뉴런 문화 (I 표 참고)

  • 조직 문화 incubators (37 ° C 5 % CO 2, 습도 조절)
  • 독일어 Desag 유리 coverslips 및 / 또는 플라스틱 조직 문화 요리
  • 폴리 - L - 라이신, 시그마
  • 무균 milliQ H 2 O
  • Neurobasal, Invitrogen
  • 열 inactivated 태아 소 혈청 (HiFBS)
  • L - 글루타민
  • B27, Invitrogen
  • 페니실린 / 스트렙토 마이신 항생제
  • 37 ° C waterbath
  • 무균 파스퇴르 Pipettes
  • 번센 가스 버너
  • HBSS, CA 2 + / MG 2 + - 무료, Invitrogen
  • DNAse, 워싱턴
  • MgSO 4
  • 원심 분리기
  • Hemacytometer
  • Trypan 블루 솔루션

참고문헌

  1. Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
  2. Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F.

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태그

Poly L lysineDCC LH2 TAG1

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