배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

요약

이 동영상은 E13 쥐 등의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 보여줍니다. Dissociated commissural 뉴런이 축삭의 성장과지도의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용합니다.

초록

Commissural 뉴런 널리 배아 척수 개발 중에 축삭의 가이드를 기본 메커니즘을 조사하는 데 사용되었습니다. 이러한 뉴런의 세포 기관은 등의 척수에 위치하고 axons은 배아 발달 동안 틀에 박힌 궤도를 따라하고 있습니다. Commissural axons 처음 floorplate 향해 ventrally 프로젝트. 정중선을 건너 후 다음 axons은 두뇌 향해 anteriorly 및 프로젝트 설정합니다. 이러한 각 단계는 여러지도 단서의 조치에 의해 규제됩니다. 높은 commissural 뉴런의 풍부한 문화가 이상적으로 돌리는 assays, immunochemistry 및 생화학을 포함하여 축삭의 pathfinding의 메커니즘을 주소 다양한 실험에 적합합니다. 여기, 우리는 E13 쥐 등의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 설명합니다. 첫째, 척수는 격리되고 지느러미 스트립이 밖으로 해부하고 있습니다. 등의 조직 trypsinization 및 기계적 방해하여 세포 현탁액에 다음 dissociated 있습니다. 뉴런은 폴리 - L - 라이신 - 코팅 유리 coverslips 또는 조직 문화 요리에 도금입니다. 30시간 후

프로토콜

1. 배아 쥐 등의 척수의 해부

일반 권장 사항

얼음 L - 15 중간을 유지하고 자주 배아는 냉각 유지하는 해부 접시에있는 매체를 변경합니다. 이것은 조직 무결성을 유지하는 데 도움이됩니다. 명시되지 않는 한 모든 단계 더몬트 # 5 포셉 두 쌍이있는 수행됩니다. 오염을 피하기 위해, 70 % 에탄올 모든 도구와 작업 표면을 스프레이하고 해부 매체 병 감아. 요리 사이의 배아를 전송하려면, 절단 플라스틱 피펫이나 천공 숟가락을 사용합니다. 그것은 성공적으로 절개를 완료하기 위해 척수를 (스트레칭, nicking) 손상하지 않는 것이 중요합니다.

준비

• 콜드 L - 15 배지
• L - 15의 50 ML + 10 %의 열 inactivated 말 혈청 (HiHS). 얼음 계속.

척수의 해부

1. 안락사 E13 임신 - 공연 쥐 (E0 = 짝짓기 일 다음 첫 날) 기관 지침에 따라 CO ₂ 챔버와 함께.을
2. 복부에 70 % 에탄올을 스프레이. 핀치, 외과 가위로 잘라 집게와 함께 낮은 복부의 피부를 당기십시오. 복강에 도달하기 위해 근육과 복막 레이어 잘리는 반복합니다. 최대 흉부로, 복부의 측면을 따라 조직을 절단하여 V - 모양의 절개를 만듭니다. 리프트 및 복강을 노출하기 위해 조직을 뒤로 당기십시오.
3. 자궁은 세 위치에서 첨부 : 낮은 센터 복부에서 두 측면 상단 모서리에서. 배아 주머 니나 사이의 조직에서 잡아하여 자궁을 들어 봐요. 얼음 L - 15로 가득 배양 접시에있는 자궁과 장소를 제거하는 결합 조직을 잘라.
4. 다음 단계는 해부 현미경하에 이루어집니다. extraembryonic 조직 및 배아 세포막에서 배아를 분리, 포셉 한 쌍의과 자궁 주머 니나 사이의 조직을 잡아. 다른 쌍으로, 표면 점막 (어두운 측면이 태반입니다)를 통해 줄일 색의 더 투명한 면을 꼬집어. 부드럽게 색의 태반 측면을 눌러 배아를 짜내다. 얼음 L - 15로 가득 배양 접시에있는 모든 배아과 장소를 제거합니다.
5. 얼음처럼 차가운 L - 15로 가득 10cm 페트리 접시에 놓으세요 배아. microscissors를 사용하여 그림 1A에 표시된 각도 머리와 후부 부분을 버려야.
   
   이러한 각도에서 절단 위치 배아 "를 아래 복부 얼굴"배치하는 데 도움이됩니다.
   
   
6. 위치 배아 "복부 얼굴 아래"(앞의 멀리 가리키며, 실험자쪽으로 향하고 후부) (그림의 1B).
7. 단단히 (그림 1C) 배아 "를 아래 핀"에 포셉를 사용하여, 한쪽에서 배아를 개최. 그것은 조직을 눈물하므로, 포셉를 이동하지 마십시오. 포셉의 다른 쌍으로, 피부를 벗기다 "개최"포셉 (그림 1D - E) 사이에있는 지역에서 시작 배아의 뒷면을 취재. 이것은이 시점에서, 세포막 (meninges)에 의해 포장이며, 척수를 노출합니다.
   
   측면에서 오히려 피부 척수 위에서보다 척수를 nicking 않도록 잡아.
   
   
8. 부분적으로 척수 (그림 1 층)의 오른쪽으로 조직을 분리합니다. 개최 포셉 수준에서 시작, 가까이 척수 가능한, 닫힌 집게로 조직을 찌르지. 그런 다음 천천히 조직의 분열 포셉를 엽니다. 이것은 척수의 지느러미 루트 신경 (DRGs)을 분리해야하고, 또한 복부 장기를 중단해야합니다. 따라서 다음 단계에서 위쪽으로 끌려가고에서 예방, 첨부. 나가기 조직은 배아로 무게를 추가 앞쪽에 및 사후 끝에 연결된 일부 조직을 둡니다. 또한, 그 조직은 나중 단계에서 배아에 개최하는 데 사용됩니다.
9. 앞쪽에 월말부터 시작, meninges를 잘라와 roofplate (그림 1g)을 따라 척수를 엽니다 갈고리 모양의 텅스텐 바늘을 사용합니다.
10. 배아에게 180도 (후부는 앞쪽에 실험자쪽으로 향하고, 거리 방향) (그림 1 시간)를 회전합니다.
    
    이것은 실험자들이 배아의 반대편에서 조직을 분리하기 위해 같은 손을 사용할 수 있습니다.
    
    
11. 이전에 분리된쪽으로 잡아하여 배아를 보유하고 동일한 방법 (1.8을 참조하십시오.)를 사용하여 나머지 측면에서 조직을 방해. 완료되면 완전히 척수의 양쪽에있는 조직을 분리합니다.
    대안 : 완전 왼쪽에있는 남은 조직을 분리하지만, 오른쪽에있는 앞쪽에 및 사후 끝에 연결된 일부 조직을 두십시오. 이것은 때때로 단계 1.12의 위치에 척수를 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
12. 그 측면에 척수를 놓고 (그림 1i) 나머지 mesenchymal 조직 및 DRGs의 대부분을 제거합니다.
13. 이 단계에서, meninges 및 척수는 서로에 apposed 조직의 두 "시트"입니다. 척추 코르에서 meninges의 짧은 구간에서 크고 앞쪽에 - 대부분의 척수 부분과 껍질을 핀D (그림 1j, 왼쪽). 자, 집게와 함께 전체 잡아서 두 분리된 세그먼트를 보유하고 부드러운, 지속적인 운동 (그림 1j)로 meninges 보지.
    고르지 척수 및 / 또는 meninges 계층의 파손으로 이어질 것 "필링". 그것은 여전히​​ meninges에 연결된 척수의 부분을 복구하기 위해 일반적으로 불가능합니다.
14. 플라스틱 피펫을 사용하여, L - 15 + 10 % HiHS을 포함하고있는 페트리 접시에 격리 척수를 전송하고 얼음에 둡니다. 일반적으로, 모든 태아의 척추 코드는 지느러미 부분을 해부하기 전에 수집하고 있습니다.

도설 척수의 해부

15. , L - 15 10%의 HiHS을 포함하는 "오픈 책"구성에 드러 누어는 배양 접시에 놓으세요 척수. 더 넓은, 앞의 부분 (hindbrain의 일부를 포함) (그림의 1K)을 버려야.
16. 등의 조직은 척수 (그림 1리터, 왼쪽)의 측면 - 대부분의 지역에 위치하고 있습니다. 직선 텅스텐 바늘로 코드를 달아 있지만, 절반 척수의 1/5th 너비입니다 스트립을 잘라 L - 모양의 텅스텐 바늘을 사용합니다. (그림 1리터, 오른쪽). 얼음 L - 15 + 10 % HiHS를 포함한 15 ML의 플라스틱 튜브에있는 등 지느러미 부착된를 놓습니다.
    ~ 12 E13 배아의 도설 신경 관 섹션 분리 후 도금을위한 ~ 3.5-4000000 세포를 얻을 수 있습니다. 더 많은 세포 등의 척수 (넓은 지느러미 스트립 절단)의 거친 절개를 수행하여 얻을 수 있지만, commissural 신경 세포의 순도가 감소됩니다.

2. Commissural 신경 세포 문화

일반 권장 사항

모든 단계가 별도로 명시되지 않는 한 조직 문화 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. 신선한 매체와 갓 해동 보충 및 시약을 사용합니다. 분리 및 분쇄 단계는 ⁺ / MG ^{2 +} 무료 HBSS 칼슘 ² 최소화하기 위해 ⁺ / MG ^{2 +에} 의존 접착 칼슘 ² 수행됩니다.

준비

• 코팅 coverslips (독일어 Desag 유리를 사용) 또는 조직 배양 플레이트 (아래 코팅 절차를 참조).
• 따뜻한 Neurobasal 도금 미디어 (아래 참조), 조직 문화 요리와 도금하기 전에 최소 1.5 H에 대한 조직 문화의 인큐베이터에서 ₂ equilibrated CO 인치
• 37 ° C waterbath에서 2.5 %의 트립신
• HBSS 칼슘 ^{2 +} / MG ^{2 +} - 무료, 4 하나 ° C, 37 ° C. 한 중 2 병
• 이 화재 - 광택 유리 파스퇴르가 직경이 절반 일반적인 크기로 하나의 절반보다 약간 작은 직경을 pipettes. 멸균 파스퇴르 pipettes를 사용하십시오. pipettes를 해고 - 폴란드어하려면 약간의 직경을 감소하기 위해 팁을 녹기 (하늘색 불꽃의 맨) 알콜 램프를 사용합니다. 이 단계는 조직 문화 후드 외부 수행하기 때문에 조직 문화 후드 아래에 배치하기 전에 70 %의 에탄올과 pipettes을 스프레이. 뉴런, 외투 막 분쇄 단계 전에 분리 또는 (미디어 pipettes을 입력하고 30 초 동안 유지)을 시작하기 전에 혈청을 포함하는 미디어와 파스퇴르 pipettes.보다 효율적인 복구를 위해 이것은 분쇄하는 동안 파스퇴르 피펫의 내부를 지키는로부터 세포를 방지할 수 있습니다.
• PLL - 코팅 요리 또는 coverslips를 세척을위한 무균 milliQ 물
• HBSS에서 12.5 % MgSO ₄ 솔루션

폴리 - L - 라이신 코팅

유리 coverslips, 24 시간 동안 산성 - 세척과 (Kaech와 뱅커, 2006 참조) 도금하기 전에 소독을 사용하는 경우. 독일어 Desag 유리 coverslips을 사용합니다.

코트 유리 또는 플라스틱 coverslips 조직 문화 요리 폴리 - L - 라이신하려면 다음 단계를 따르십시오

• 조직 문화 후드 아래 1.75-2 시간 100 UG / ML PLL 솔루션의 작은 돔을로 표면을 커버.
• milliQ 물, 세척 당 적어도 5 분 (아래의 세포 분리의 단계에서 수행할 수 있습니다)으로 두 번 씻는다.
• 사용까지 물속에 저장합니다. PLL - 코팅 표면이 건조하게하지 마십시오.
  coverslips 코팅을위한 PLL 소모를 줄이기 위해, 살균 세균 배양 접시에 coverslips를 놓습니다. 문장과 coverslips에 액체 돔을 배치하여 coverslips 씻으십시오. 세균 배양 접시는 소수성이므로, 액체는 유리 coverslips에 남아 있습니다. 그냥 세포를 도금하기 전에 조직 문화 요리 coverslips를 전송합니다.
  플라스틱 조직 문화 요리에 도금 뉴런에, 접착력이 정상적으로 높습니다, 그러므로 neurite 연신율이 줄어들 수 있습니다.

해리와 도금

1. 지느러미 스트립이 튜브 하단으로 해결되었는지 확인합니다. 파스퇴르 피펫으로 L - 15 10%의 HiHS의 대부분을 제거합니다. 빠르게 감기 (4 ° C) HBSS 3 ML 추가하여 한 번 등의 신경 튜브에 부착된 씻는다.
2. 등의 신경 튜브 스트립 2 분 동안 정착하자, 다음 파스퇴르 피펫으로 HBSS를 제거합니다.
3. 4.7 ML의 볼륨에 따뜻한 (37 ° C) HBSS를 추가합니다. 티암탉이 0.15 %의 트립신의 최종 농도를 제공 2.5 %의 트립신의 0.3 ML를 추가합니다.
4. 37 ° C 7 분에 대한 waterbath에 품어. 부화를 통해 한 번 부드럽게 절반 섞는다.
5. 150 U / ML의 최종 농도 30 μl DNAse을 (25 000 U / ML) 추가합니다. MgSO ₄ 60 μl를 추가하고 0.15 %의 최종 농도에 대해, 간략하게 섞는다.
   들어 37 여분 1 분 품어 거친 해부에서 조직, 각하 waterbath에서 C.
   
   이 단계에서는 지느러미 신경 튜브 섹션을 조각한다. 등의 신경 튜브 섹션 조각을 시작하지 않은 경우 일반적으로 2.5 %의 트립신 재고가 된 것을 의미하고, 새로운 주식은 해동해야하거나, 차가운 HBSS로 세척 효과적으로 샘플에서 HiHS을 제거하지 않았다.
6. 4 분에 대한 200g에서 조직 조각을 원심 분리기.
7. 튜브의 아래쪽에 액체 ~ 50-100 μl를 떠나, 파스퇴르 피펫으로 뜨는을 제거합니다.
8. 펠렛를 풀어야 부드럽게 튜브를 플릭 후 따뜻한 HBSS 5 ML을 추가하여 세포를 씻으십시오. 2 분 실온에서 해결하자.
9. 5 분 200g에 원심 분리기.
10. 튜브의 아래쪽에 액체 ~ 50-100 μl를 떠나, 파스퇴르 피펫으로 뜨는을 제거합니다.
11. 튜브가 부드럽게 펠렛을 느슨하게하고 부분적으로 세포를 resuspend 플릭. 그렇다면 따뜻한 HBSS 2 ML를 추가합니다.
12. 작은을 사용 (하프 직경) 화재 - 광택 유리 파스퇴르 피펫 천천히 4-6 번 및 다운을 pipetting하여 세포를 떼어 놓다 수 있습니다. 거품을 만드는 않도록하고, 튜브의 측면에 대한 액체를 피펫. 오버 씹다하지 마십시오.
13. 더 천천히 3-4 회를 - 및 - 위아래로 pipetting하여 세포를 떼어 놓다에 작은 불을 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 거품을 만드는 않도록하고, 튜브의 측면에 대한 액체를 피펫. 오버 씹다하지 마십시오.
    거친 해부에서 조직은 분리의 끝에있는 튜브에 따뜻한 HBSS의 추가 1 ML를 추가합니다.
    세포를 dissociating 때, 그것은 모든 세포 대단히 짧은 시간 및 집계를 떼어 놓다 필요는 없습니다. 상하 pipetting 중단하거나 추가로 pipetting과 세포 집계의 크기에 더 이상 감소하지를 참조 없다면 작은 직경 파스퇴르 피펫로 변경합니다.
14. 남아있는 조직 조각 1 분 튜브에 정착하자. 그것은 새로운 튜브에 세포를 전송할 필요가 없습니다.
15. 세포 현탁액 20 μl를 가지고 trypan 파랑 5 μl를 추가합니다. 혈구계에 세포를 계산합니다.
    뉴런은 trypan 파랑 제외하여 ≥ 95% 가능한되어야합니다.
16. Neurobasal 도금 미디어의 뉴런 (아래 요리법 참조) 플레이트.
    • 격리 뉴런을 (낮은 밀도 문화가 clumping 또는 서로 중복 뉴런을 피하기 위해) 취득을위한 제안 도금 밀도 :
    • 120 000-180 000 세포 / 음 6 웰 플레이트에 대한
    • 60 000-75 000 세포 / 12 잘 잘 접시
17. 16-18시간 후 (아래 요리법 참조) Neurobasal 성장 미디어로 미디어를 변경
    마 미디어를 변경할 때 문화 요리에서 미디어를 대기음에 진공 펌프를 사용하지, 부드럽게 피펫을 사용합니다. 이것은 뉴런을 dislodging 방지됩니다.

대표 결과 :

네 시간 도금 후 뉴런은 폴리 - L - 라이신 (PLL) 코팅 표면을 준수해야한다. 위상 콘트라스트 조명 아래 준수 세포 기관은 일반적으로 비교적 평평하고 (그림 2A) 타원 모양입니다. 잘 준수하지 않은 세포는 요리가 매우 부드럽게 측면에 도청 때 약간 이동 분야로 나타납니다. 많은 요인은 잠재적으로 (토론 참조) 세포의 접착력을 방해할 수 있습니다.

체외에서 30 시간 후, 대부분의 뉴런은 눈에 띄는 성장 원추 (그림 2C, D)와 축삭을 확장했습니다. 가난한 axonal 성장이 관찰되면 Neurobasal 성장 미디어가 신선한 매체와 보충으로 만든되었는지 확인하십시오. 뉴런은 이러한 조건에서 최소한 6 일 동안 건강하게 남아있다. 이 절차는 ~ 뉴런의 90 %가 DCC을 (얨 외. 2009) 표현과 함께, 안정적으로 높은 commissural 뉴런에 풍부 준비를 항복을 입증했다. 세포 현탁액을 준비에 사용되는 등 부분의 척수 스트립의 너비가 얇은 스트립을 사용하는보다 순도와 문화의 순도에 영향을 미칠 것입니다. 예를 들어 응용 프로그램은 그림 3 (immunofluorescence)에 표시됩니다. 얨 외하여 문서를 참조하십시오. (2009) 더 많은 예제.

그림 1. 척수의 해부 단계의 설계도. D = 도설, V = 복부. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 절연 commissural 대표 결과뉴런은 PLL - 코팅 유리 coverslip에 도금. A, B) 도금 후 4 시간 뉴런의 표면을 준수합니다. 바 = 20 μm의. C, D) 도금 후 30 시간은 대부분의 뉴런은 눈에 띄는 성장 원뿔있는 축삭을 확장했습니다. 바 = 20 μm의.

그림 3. commissural 신경 세포가 phalloidin (F - 굴지, 빨강)과 DAPI (파란색)에 의해 핵으로 표시된 F - 굴지와 감마 - tubulin (녹색)에 대한 immunostained.

조리법 및 주석

Neurobasal 도금 미디어

• Neurobasal
• 10% 열 inactivated FBS (HiFBS)
• 이 MM L - 글루타민 (200 MM 주식 솔루션에서)
  옵션 : 페니실린 / 스트렙토 마이신의 항생제 (하프 정상 농도를 사용)

Neurobasal 성장 미디어

• Neurobasal
• B27 (재고의 50분의 1 희석)
• 이 MM L - 글루타민 (200 MM 주식 솔루션에서)
• 옵션 : 페니실린 / 스트렙토 마이신의 항생제 (하프 정상 농도를 사용)
  
  미디어가 만든되면, 그것은 두 주 동안 4 ° C에 보관하실 수 있습니다. 최소 1.5 시간 동안 세포, 조직 문화 배양 접시에 장소 미디어 및 조직 문화 배양기에서 자리를 도금하기 전에 온도와 미디어의 산도를 평형 수 있습니다.

Neurobasal

Neurobasal 매체의 병이 열린 후에, 그것은 4 한 달 동안 보관 수 있습니다 ° C를 어둠에 약해. 달리 세포 생존이 낮은 것입니다 이상 한 달 동안 개설되었습니다 Neurobasal 배출.

열 inactivated 태아 소 혈청 (HiFBS) 또는 말 혈청 (HiHS)

56려면 열 inactivate FBS 또는 HS, 열 ° 30 분 동안 물을 욕조에 C. 소용돌이 병은 약 10 분 간격 정도. 열 inactivated FBS가 precipitates 취소 centrifuged해야 할 수 있습니다 (정확도 장소.이 시점에서 타이밍을 시작합니다. 56 ° C에 도달하면 볼 수있는 물통에있는 온도계. 물이 가득 유사한 크기의 병을 사용), 그리고 -20 ° C.에 aliquoted하고 다시 냉동 수 있습니다

L - 글루타민

항상 각 실험에 대한 L - 글루타민의 신선한 나누어지는를 녹여.

B27

B27의 Aliquots는 ° C 장기 저장하거나, 4 ° C 1 개월 최대 20 보관하실 수 있습니다.

토론

우리는 배아 쥐의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 설명합니다. 이 절차는 정기적으로 안정적으로 축삭지도의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 뉴런을 준비하기 위해 우리가 실험실에서 사용되고 있습니다. 세포 생물학 및 immunochemistry 실험 한 쓰레기의 해부에 충분한 신경을 생산하고 있습니다. 더 많은 세포가 필요로하는 경우 등 많은 생화학 실험, 두 새끼의 절개처럼이 필요할 수 있습니다. 훈련된 사람, 해부 및 ~ 20 배아의 분리는 이하의 4 시간 만에 수행할 수 있습니다. 긴 timescales는 조직 무결성의 변화로 인해 척추 코드보다 어려운 절개가 발생합니다, 또한 가능한 뉴런의 효율적인 복구를 손상하실 수 있습니다.

처음으로 절차를 수행하면, 비교를위한 다양한 PLL - 코팅 표면에 플레이트 세포 (산성 - 세탁 유리 coverslips, 조직 문화 요리). 일반적으로 세포는 PLL - 코팅 플라스틱 조직 문화 요리 또는 ...

재료

배아 쥐 등의 척수의 해부 (표도 I 참조)

• E13 쥐 임신 - 연출
• 에탄올 70%
• 외과 가위, 파인 과학 도구
• 집게, 더몬트 # 5, 파인 과학 도구
• 배양 접시
• L - 15 배지
• 해부 현미경, Leica
• 플라스틱 전송 pipettes
• Microscissors, 파인 과학 도구
• 텅스텐 바늘과 핀 홀더 (한 후크 모양의 바늘 한 L - 모양의 바늘 한 바늘 직진), 파인 과학 도구
• 열 inactivated 호스 세럼 (HiHS)
• 15 ML 플라스틱 튜브

Commissural 뉴런 문화 (I 표 참고)

• 조직 문화 incubators (37 ° C 5 % CO _2, 습도 조절)
• 독일어 Desag 유리 coverslips 및 / 또는 플라스틱 조직 문화 요리
• 폴리 - L - 라이신, 시그마
• 무균 milliQ H ₂ O
• Neurobasal, Invitrogen
• 열 inactivated 태아 소 혈청 (HiFBS)
• L - 글루타민
• B27, Invitrogen
• 페니실린 / 스트렙토 마이신 항생제
• 37 ° C waterbath
• 무균 파스퇴르 Pipettes
• 번센 가스 버너
• HBSS, CA ^{2 +} / MG ^{2 +} - 무료, Invitrogen
• DNAse, 워싱턴
• MgSO ₄
• 원심 분리기
• Hemacytometer
• Trypan 블루 솔루션