FM의 염료는 시냅스 역학의 이해에 귀중한 도움이되었습니다. FMS는 일반적으로 다른 자극 조건 동안 형광 현미경으로 다음 있습니다. 그러나, 전자 현미경과 함께 FM 염료의 photoconversion는 시냅스 부튼스의 다른 ultrastructure 구성 요소 간의, 서로 다른 시냅스 소포의 수영장의 시각화 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
플라즈마 막 (exocytosis)와 시냅스 vesicles의 융합은 신경 전달 물질 릴리스와의 연결을 통신에 필요한 단계입니다. 그들이 새로운 엑소과 endocytosis주기 (소포 재활용)을 받아야 때까지 vesicles 그런 다음, 플라즈마 막 (endocytosis)에서 검색 및 신경 터미널 내에 vesicles의 일반 수영장과 함께 그룹화됩니다. 이러한 프로세스는 이러한 전자 현미경, 전기 생리학 녹음, amperometry 및 커패시턴스 측정과 같은 기술을 사용하여 다양한 연구하고 있습니다. 중요한 것은 지난 20 년간 동안 찬란 분류 마커의 숫자는 광학 기술들이 재활용 역학 vesicles를 추적할 수있게 나타났다. 가장 일반적으로 사용되는 마커 중 하나는 styryl 또는 FM 염료 1, 구조적, 모든 FM 염료는 친수성 머리와 아로마 링과 하나 이상의 이중 채권 (그림의 1B)을 통해 연결된 lipophilic 꼬리가 포함되어 있습니다. vesicles의 수영장 레이블 클래식 FM 염료의 실험 (전기 또는 높은 K +와 함께) 신경의 자극 동안 염료와 준비 (그림 1Ai)를 목욕으로 구성되어 있습니다. 이것은 최근 endocytosed vesicles (그림 1A I - III)에 소포 재활용 및 염료의 후속 로딩을 유도. 염료, 염료없는 욕조에서 자극의 두 번째 라운드로 vesicles 로딩 후 exocytosis를 통해 FM 릴리스 (그림 1A IV - V), 형광 강도 감소 (destaining)를 모니터링하여 다음 수있는 프로세스를 실행하는 것입니다.
FM 염료는 소포 재활용 분야에 크게 공헌했지만, 그것은 종래의 형광 현미경을 사용하여 개별 vesicles의 정확한 지방화이나 형태를 결정하는 것은 불가능합니다. 그런 이유로, 우리는 어떻게 FM 염료가 photoconversion 통해 전자 현미경을 사용하여 endocytic 마커로도 사용될 수 있습니다 여기에 설명합니다. photoconversion 기술은 강한 조명 아래의 반응 산소 종을 생성하는 형광 염료의 속성을 이용. 찬란 분류 준비는 diaminobenzidine (DAB)을 포함하는 솔루션에 빠져들와 조명입니다. 염료 분자에 의해 생성되는 반응 종족은 어두운 모습을 쉽게 전자 현미경 2,3로 구분할 수 안정, 불용성 침전물을 형성 DAB를 산화. DAB에만 형광 분자 (반응 산소 종은 단기 살고 있으므로)의 바로 근처에 산화되기 때문에, 기술은 찬란 표시된 구조는 전자 - 밀도 침전물을 포함 될 것을 보장합니다. 기술은 따라서 적극적으로 organelles을 재활용의 정확한 위치와 형태의 연구를 수 있습니다.
프로토콜
Drosophila melanogaster의 연결 근육질 교차로 1) 준비 (NMJ)
- 표준 Drosophila 호수 (130 MM NaCl, 36 MM의 자당, 5 MM KCl, 2 MM CaCl 2, 2 MM MgCl 2, 5 MM Hepes, 산도 7.3 4 준비합니다.
- 식염 (1.1)의 준비를 해부하다. Drosophila의 애벌레는 Sylgard 접시에 지느러미 측면까지 pined이며 지느러미쪽에 세로 sectioned이며, 내장은 제거됩니다. 준비 나서 뻗어와 pined 있습니다. 여러 복부 근육 그런 다음 사용할 수 있습니다.
2) 자극과 FM 염색법
- 표백에서 FM 염료를 보호하기 위해, 낮은 조명 조건에있는 모든 다음 단계를 수행하는 것이 좋습니다입니다.
- 신경의 화학적 자극에 대한 높은 칼륨 버퍼가 사용됩니다. KCl 90 MM 및 FM1 - 43 염색 10 μm의를 포함하는 Drosophila 호수 (1.1 참조) 준비합니다. 조명으로부터 보호 솔루션을 유지.
- 실온에서 1 분 이전에 준비를 버퍼로 준비 목욕탕.
- 세포외 FM1 -....
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토론
몇 가지 중요한 단계를 고려해야한다 :
- DAB 보육은 준비 철저한 세척과 담금질 후에 실시하여야한다. 그렇지 않은 반응 글루 타 알데히드는 DAB과 상호 작 용할 수 있으며 (일반적으로 고밀도 전자되지 않은 평면 결정의 형태로)의 강수량을 일으킬 것입니다. 이 강수량이 넘치게 이루어지는 준비는 전자 현미경에 대한 거의 사용할 수 있습니다.
- 조명 시간은 다른 조명 시간을 몇 가지 동일한 준비를 테스트하여 최적화해야합니다. 우리의 경험에서 최적의 변환 (그림 2B)은 약 5 분 시간 창 (예 : 35 사이에 40 분 조명의 시작 후)에 이루어진다. 부족 조명 (그림 2A)이 표시 organelles 부족, 및 / 또는 부분적으로 표시된 organelles (예 : 자신의 부피의 절반 밖에에서 DAB를 포함 나타나는 vesicles)에 의해 특징입니다. 긴 조명 반면, DAB 변환 제품이 축적을 통해 변환, 결과는 cytosol (그림 2C)에 organelles과 탈출을 왜곡. 준비가 거의.......
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon 수지 | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM 등급 |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 대물렌즈 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | 건식 대물렌즈 | |
| 100W Hg 램프 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 후면 거울 포함 램프 하우징 | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm 카메라 | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | 이미지 획득 |
| excitation 필터 (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| 다이크로익 필터 (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| emission 필터 (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| 전자현미경(EM) | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
참고문헌
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog mo....
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