엄마가 magnetosome 활성화에 참여하는 표시되었습니다 독특한 Magnetosome 관련된 단백질이다. 여기에서 엄마가 삭제 돌연변이의 정화 프로토콜 (MamAΔ41)을 제시 M. magneticum AMB - 1.
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방법 논문
의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41
이 논문에서
요약
초록
Magnetotactic 박테리아는 지자기의 필드 함께 스스로를 동쪽을 향하게 수 있습니다 수생 미생물의 다양한 그룹을 구성. 이 문제는 적합한 환경에서 검색을 돕기 위해 생각됩니다
프로토콜
1. E.에 엄마가 진의 복제와 표현 대장균
5' - GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG - 3 '와 5' - GCGCGGCAGCCATA - TGGCATACG - 3'돌연변이 유전자 mamAΔ41는 primers와 Magnetospirillum magneticum AMB - 1의 게놈 DNA의 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 증폭되었습니다. 증폭된 DNA 조각에서 NcoI 사이트는 개시 코돈 ATG에서 도입하고 종료 코돈은 ScoI 사이트로 교체되었습니다. 조각은 NcoI와 SacI와 소화하고 pET52b (+)의 각 사이트에 복제, pET52bMamAΔ41 - AMB1에 상승을 제공했다. 이 구조에서 mamAΔ41 유전자는 C - 말단에있는 10 그 태그로 프레임에 융합되었다. 플라스미드는 대장균 E. 스트레인 BL21에 electroporated되었습니다. E. 대장균은 pET52bMamAΔ41을 품고 BL21가 (15) 자동 유도에서 3 시간 동안 암피실린 (50 MG / ML) 310 ° K를 포함하는 매체를 성장했다 변형. 재배 온도는 310 °에서 다음 300 ° K로 이동 300 ° K.시 추가 48 H에 대한 유지....
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토론
단백질 정제는 생화학 단백질이나 구조 연구의 주요 단계입니다. 각각의 단백질 자체 동작과 독특한 있기 때문에 하나의 속성을 정의하고 이에 따라 그 정화를 수정해야합니다. 단백질 대상은 생물 정보학 도구를 사용하여 정화위한 첫 단계로 분석을해야합니다. 그들은 대상 ISO - 전기 지점을 계산 환경 및 특수 이온 / 리간드에 대한 필요성을 감소 / 산화에 대한 필요성을 평가하는 데 사용됩니다. 대상 독자성을 반영 우리 프로토콜의 몇 가지 중요한 변경 사항이 있습니다. 이러한 수정은 버퍼, 작동 온도 및 열 조정이 포함됩니다.
첫 번째 중요한 수정 사용 (섹션 3.3)는 버퍼가 올바른 산도 범위, 이온 / 리간드와 단백질의 안정성과 기능에 필요한 이온 강도를 반영하기 위해 변경해야 할 버퍼입니다. 목표가 불안정의 기호 (열화, 강수량이나 기능의 손실)을 표시하는 경우 하나가 테스트하고 다른 더 적당한 버퍼를 검색합니다. 또 다른 중요한 문제는 정화 속도와 작동 온도입니다. 이 단백.......
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감사의 글
우리는 그들의 조언과 의견을 자신의 지원과 Geula 다비도프, 노암 Grimberg와 첸 박사 Guttman에 대한 아미르 Aharoni을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 프렌치 프레스(French Press) | 장비 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-078A | |
| 압력 셀(Pressure cell) | 장비 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 | |
| 초원심분리기 | 장비 | Sorvall, Thermo Scientific | Discovery 90SE | |
| 로터(Rottor) | 장비 | Beckman Coulter Inc. | Ti60 | |
| 초원심분리기 튜브; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | 장비 | Beckman Coulter Inc. | BC-355618 | |
| 직경 2.5cm, Glass Econo-Column 크로마토그래피 컬럼 | 장비 | Bio-Rad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind 레진 | 장비 | Novagen, EMD Millipore | M0063428 | |
| 분광광도계 | 장비 | Amersham | Ultraspec 2100 pro | |
| 석영 큐벳 | 장비 | Hellma | 104-QS | |
| 고속 액체 크로마토그래피- AKTA purifier 10 | 장비 | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| 이온 교환 컬럼 – MonoQ 4.6/100 PE | 장비 | GE Healthcare | 10025543 | |
| 크기 배제 충전 컬럼-HiLoad 26/60 Superdex 200 | 장비 | GE Healthcare | 17-1071-01 | |
| Centricon - Vivaspin15 – 10,000 MWCO | 장비 | Sartorius AG | VS1501 | |
| 탁상 원심분리기 | 장비 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | 장비 | Bruker Corporation | Reflex IV | |
| Tris-HCl ((hydrotymethyl) aminomethane) | 시약 | BioLab | 20092391 | |
| 염화나트륨 | 시약 | FRUTROM | 235553470 | |
| 이미다졸(Imidazole) | 시약 | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 | 시약 | Sigma-Aldrich | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | 시약 | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| 우혈성 트롬빈(Bovine Thrombin) | 시약 | Fisher Scientific | BP25432 | |
| 글리신(Glycine) | 시약 | BioLab | 07132391 | |
| 도데실 황산나트륨 (SDS) | 시약 | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercapto–ethanol | 시약 | Sigma-Aldrich | M-3148 | |
| InstantBlue | 시약 | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | 시약 | Fermentas | SM0671 |
참고문헌
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes. Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).
- D'Andrea, L. D., Regan, L. TPR proteins: the versatile helix. Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).
- Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F,
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