마우스 Oocytes의 검색

요약

이 프로토콜은 생쥐의 수란관에서 추출 oocytes 또는 초기 단계 수정된 배아에 대한 기법을 보여줍니다. infindibulum를 식별하고 그것에 뭉툭한 끝을 바늘을 삽입하는 기능은 제대로 절차를 수행하는 것이 필수적입니다.

초록

지금까지 단 몇 연구 Peromyscus embryogenesis 또는 생식 생물학의 성공적인 조작을보고있다. 함께 Peromyscus 유전 증권 센터 (http://stkctr.biol.sc.edu)로, 우리는이 시스템을 개발하는 데 필요한 돌출 차이를 특성화하고 있습니다. 기본 목표는 oocyte / 초기 배아 검색을 최적화되었습니다.

프로토콜

배아 / Oocyte 검색

1. 이전 배아 / oocytes의 검색에 적어도 두 시간은, KSOM가 37 º C CO ₂ 배양기와 FHM에 배치됩니다는 -20 °에서 해동의해야합니다. 세 오목한 얕은 우물을 포함하는 유리 그릇은 인큐베이터에 KSOM의 집 방울하는 데 사용됩니다. 탈수 방지하기 위해, KSOM와 접시는 바닥에 물이있는 lidded 컨테이너에 배치됩니다. 이 장치는 광유를 사용하지 않고 증발을 방지합니다.
   
   
2. 앤 여성에서 oviducts는 FHM 미디어에 배치됩니다. 오리 엔테이션 및 손상 infindibulum을 보장하기 위해, 난소의 작은 섹션은 자궁의 수란관 작은 섹션과 함께 절단됩니다. 뭉툭한 30 게이지 바늘이 infindibulum에 무딘 바늘을 삽입하여 수란관에서 배아 / oocytes을 추방하는 데 사용됩니다. 수란관 튜브 통과하기 위해 바늘에 비해 너무 작습니다 때문에 infindibulum는 배아를 검색하는 데 사용해야합니다. infindibulum이 파괴되는 경우, 수란관이 중 오픈 슬라이스 또는 배아 압박이 있어야합니다.
   
   
3. 배아 / oocytes는 페트리 접시의 바닥으로 가라앉아있는 기름 방울에 현미경을 집중하여 FHM 미디어에서 찾을 수 있습니다. 이것은 높은 배율보다 큰 가시 영역을 제공하는 등 배아 / oocyte 격리는 20x에서 달성될 수있다. 배아 / oocytes는 주위 명확한 반지를 가지고있는 원형 지방 방울 같아. 모세관 뽑아 유리를 사용하여 입으로 pipetting은, 부화 및 추가 조작에 대한 KSOM에 배아 / oocytes를 이동하는 데 사용됩니다.

Oocyte 정보 검색을위한 절차

준비

1. FHM를 해동하고 kSOM을 준비합니다.
2. 몇 시간 전에, 아래의 물과 팁 상자, CO ₂ 배양기에서 장소에 달걀 검색 컨테이너와 장소에서 적절한 kSOM.
3. 연구실에 새장을 지참하고 수확 여성을 죽일.
4. 당신이 수란관의 일부를 잘라하지 않도록하기 위해 난소의 일부와 자궁의 일부를 잘라주의되는 수란관을 잘라 버릴거야.
5. 작은 배양 접시에있는 FHM 미디어에 놓습니다.
6. 플러싱에 사용되는 몇 가지 더 FHM 미디어 페트리 요리를 붓고.

홍조

1. 나선형 엔드와 1ml 바늘에 연결된 플러싱 바늘 (30 게이지 퉁명스러운)를 사용합니다.
2. 난소의 부분 첨부된 왼쪽 근처에서 발견 infundibulum에 삽입 시간과 바늘을 사용하여 하나의 수란관을 가져가라. infundibulum이 파괴되고 사용할 수 없다면, 그럼 두 포셉을 가지고 수란관의 한쪽 끝을 잡고. 다른 forcep으로 부드럽게 모든 배아의를 꺼내, 치약 튜브처럼, 짠다.
   
   참고 : 조직의 많은 그것 같이되므로이, 페트리 접시에 엉망이 다량을 생성하므로 나중에 다른 페트리 접시를 사용할 수 있습니다.
   
   
3. , 배아를 참조 지방 조각에 현미경을 집중하고 주변 클리어 서클과 원형 "지방 조각 '을 찾기 위해.
   
   참고 : 배아는 지방과 같은 모양을 가지고 있으므로 그것이 찾기 힘들 수 있습니다. 태아가 아래로 침몰, 그래서 거기에 봐요.
   
   
4. 받는 여성의 질 얼룩을 마십시오. 이 단계에서, 그들은 pseudopregnant해야합니다.

토론

이 문서에서는, 우리는 배란 유도 (superovulated) Peromyscus에서 oocytes의 검색을 보여줍니다. superovulation의 사용은 (천연 estrous 사이클 반대) 때문에 훨씬 더 결과 숫자로 일반적입니다. 그러나,주의는 배란과 culturing를 유도하는 데 사용되는 호르몬이 모두 영향을 수 있으므로, 이러한 oocytes / 배아를 이용 결과를 해석에 촬영해야합니다.

estrous이 확정되면, 암컷은 euthenized와 oviducts는 난소의 일부와 함께 회복되었습니다. 난소의 작은 지역은 infindibulum의 위치를​​ 표지로 사용됩니다. infindibulum은 종종 시간은 조직의 얇은 계층을 통해 돌출, 난소 옆에 앉아있다. 이 조직의 다른 측면에서 수란관의 나머지 코일되고 결국 질로 연결됩니다. oocytes를 추출 infindibulum를 통해 유체를 밀어하는 것이 좋습니다. 이 방향으로 인해 질 - 수란관 인터페이스에있는 편도 밸브가 필요합니다. 그들은 밸브를 통해 거꾸로 예상하는 경우 oocytes...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플러싱 니들	도구	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
포셉 (2)	도구	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	동물	Peromyscus Genetic Stock Center
가위	도구	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES 완충 배지	시약	Specialty Media	MR-025-d
KSOM 배아 배양 배지 (5x 10 mL)	시약	Specialty Media	MR-020P-5F
마우스 피펫	도구			유리 모세관을 가늘게 늘려 고무 튜브에 연결함
난자 홀딩 디쉬	도구			오목한 홈이 있는 유리 용기