버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Summary

유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을 설명 Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을 설명

Protocol

A.의 세포 배양 및 단백질 유도

이 섹션은 효모 세포에서 regulatable 발기인의 단백질 표현의 유도로 다음 세포 배양 조건, Nocodazole와 세포주기 동기화를 설명합니다.

1. 야생 유형 효모 스트레인 W303 (leu2 - 3, 112 trp1 - 1 can1 - 100 ura3 - 1 ade2 - 1 his3 - 11, 15)은 통제하에 관심을 우리의 유전자 (ENTH2)이 포함되어 높은 사본 (2μ) 플라스미드 DNA로 변환됩니다 메티오닌 - repressible 발기인 (MET25)의. 메티오닌 부족한 미디어 최대한의 표현을 허용하면서 메티오닌 2mM는 모터의 활동을 억제하기 위해 충분하다. 따라서, 메티오닌 농도의 범위가 원하는 수준에서 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. W303 세포에 플라스미드 DNA의 1 변환은 표준 절차에 따라 LiAc - TE 방법을 사용하여 이루어집니다 ^2.
   참고 :이 실험에만 배경 수준의 단백질 발현을 위해 메티오닌 2mM 앞에서 밤새 세포를 성장에 의해 수행되어야합니다. 다음 날 아침은 단백질 표현식은 메티오닌 즉시 다음과 같은 세포주기 동기화 (약 4h) 부족 미디어 세포를 resuspend....

Discussion

이 프로토콜은 단백질 overexpression시 형태학의 표현형 (적절한 세포 분열을 거쳐 수없는 효모 세포)의 개발을 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 절차를 수행할 때 그것은 빠른 속도 전지하고, 모호한 결과를 손상 수 있으므로 권장 원심 분리 속도 pelleting하여 효모 세포를 수확하기 위해 기억하는 것이 중요합니다. 메틸렌 블루와 Calcofluor 흰색들은 독성으로 직전 이미징에 세포를 사는에 추가되어 있어야합니다. 이 절차는 또한 쉽게 대상이 제어 모터의 표현 제공, 단백질 탄압 조건 하에서 관찰 phenotypes에 대해 적용할 수 있습니다.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	시약	Sigma-Aldrich	M1404
메틸렌 블루 1% (w/v)	시약	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	시약	Sigma-Aldrich	F3543
바셀린	시약	VWR international	VW3339-2