$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1 부. 구체적이고 현지화된 RNAi의 대상이 Drosophila Imaginal 윙 디스크의 준비.
생물 학적 소재로, 우리는 GAL4/UAS 시스템 1에 의해 언어 및 특정 유전자 입을 대상이 유전자 변형 애벌레에서 얻은 Drosophila imaginal 윙 디스크를 사용했습니다. 하나 GAL4 드라이버 UAS 응답 두 번째를 가지고이 애벌레 자손은 두 부모의 라인과 관련된 유전자 십자가에서 orginates. 특정 시간적 및 / 또는 공간적 패턴에 GAL4을 표현하는 것 외에도, 드라이버 라인은 GAL4 표현 도메인을 시각화 수 UAS - GFP 기자를 수행합니다. UAS 응답 라인, UAS 시퀀스의 통제를 받고 특별히 관심을 선택한 유전자 (유전자 X 불러야 2) 타겟팅할 수 RNA (hpRNA)을 입을 헤어핀을 표현. 일단 세포로 표현, hpRNA X는 특별히 선택된 유전자를 침묵 할 수 작은 간섭 RNA (siRNA)를 생성 죽습니다. 애벌레 자손에서, 그 드라이버와 UAS - 입을 구조에만 GAL4 단백질을 표현하는 그 세포 베꼈는데는 응답 transgenes을 모두 실시하고, 따라서 선택된 유전자 X의 공간 제한 입을를 유도 수 있습니다
가능한 응용 프로그램의 다양한 가운데, 우리는 engrailed - GAL4의 통제하에 우리의 관심이 선택한 유전자 (유전자 X) (EN) 드라이버, 날개 디스크 3의 후부 구획에서 특정 입을를 실행할 수있는 침묵이 접근 방식을 적용 , 그의 영토는 UAS - GFP transgene의 표현에 의해 표시되었다.
침묵 imaginal 날개 디스크가 손으로 해부 특히 주변 오염 조직, 준수 tracheas를 제거하기 위해 돌보는했다. 각 절연 날개 디스크 다음 신속하고 부드럽게 선택 영역의 즉각적인 레이저 microdissection을위한 이전 처리, RNase 무료 해부 프레임으로 전달했다.
2 부. 날개 디스크의 침묵 (후부)와 unsilenced (앞쪽에) 구획에서 선택한 영역의 레이저 microdissection.
그리고 unsilenced (앞쪽에, GFP - unlabelled) 구획이 실현되었다;되면 날개 디스크 침묵 (GFP - 표시 후부)에서 특정 영역의 레이저 microdissection은 멤브레인을했다. 이것은 쉽게 모두 들어갈 수있는 영역을 그림으로 수행 되었음 디스크의 GFP - 긍정적이고 부정적인 측면 GFP -. microdissector 아래, 우리는 먼저 선택한 경계선을 잘라 만드는 GFP 양성 세포에 레이저 광선을 하였다. microdissector 선택한 속도와 전력 절감과 함께 진행지만, 조직의 선택된 영역 아래에있는 튜브에 폭포까지 그것은 수동으로 절단 범위를 좁힐 수 있습니다. 이 튜브는 GFP 양성 세포는 이후 RNA 추출을위한 준비가되도록, TRI 시약의 작은 볼륨을 포함하고 있습니다.
우리는 이후 unsilenced, GFP - 부정적인 조직에서 이에 상응하는 지역을 해부하다하기 위해, 날개 디스크의 GFP - 부정적인 측면, 반대로 절단 영역을 옮겼습니다. 다시 한번, 자동 절단 후, 우리는 수동으로 절단을 수정하기 위해 진행. 일단 상처는 RNA 추출을위한 준비 또한 GFP - 부정적인 조직이 TRI 시약에서 발견되었습니다, 완료했다.
부 3. Microdissected 조직 분야에서 RNA 추출 및 전송 프로파일.
우리는 모자에서 액체를 분리하기 위해 튜브를 늘인 다음 표준 TRI 시약 프로토콜 다음 RNA 추출을 수행하는 1 ML에 TRI 시약을 추가했습니다. 충분한 자료를 수집하기 위해, 우리는 100 imaginal 날개 디스크에있는 절단 절차를 반복했다. 5000에 대한 μm의이 각각 100 지역에서 시작, 우리의 수율은 RNA 1.5 μg의되었습니다. 매뉴얼 해부의 정확도는 다음 랜덤 Hexamers와 cDNA 합성하는 슈퍼 스크립트 III (Invitrogen)를 사용하여 RT - PCR에 의해 침묵과 unsilenced 샘플에서 GFP 발현을 선택하여 제어했습니다. 함께 자사의 규제 경로의 putative 대상의 사람과 침묵 유전자 X의 표현 수준을 결정하기 위해 주력하고 이후 정량 분석은 마스터 믹스 (Invitrogen)을 사용하여 실시간 RT - PCR에 의해 수행되었다.