자수 성 가한 Cytospin 장치를 사용하여 인간 Pluripotent 줄기 세포의 Immunocytochemical 분석

요약

세포 - 표면 마커에 대한 인간의 pluripotent 줄기 세포의 중지 immunocytochemical 얼룩 (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4)가 관측 및 부량에 대한 세포 monolayer을 생성하기 위해 스스로 만든 cytospin 장치의 사용을 기반으로 달성했다.

초록

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 인간의 유도 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs)를 포함 인간 pluripotent 줄기 세포 (hPSCs)은 무한한 자기 갱신 기능 및 여러 세포 유형으로 구별하기 위해 잠재적으로 인해 흥미로운 셀 소스입니다. hPSCs의 pluripotent 상태는 일반적 qPCR, immunocytochemistry 같은 방법으로 평가, 그리고 기타로

프로토콜

1 부 : 서스펜션 Immunocytochemical 스테 이닝

1. 세포는 단일 세포 현탁액에 수확하고 있습니다.
2. 세포는 다음 1.5 2mL microcentrifuge 튜브로 옮겨 4 분 200g에 centrifuged 있습니다.
3. 세포 표면에 뜨는을 aspirating에 의해 씻겨 있으며, PBS의 1mL에 다시 일시 중지 - ^{(MG이없는 +} 및 CA ^{2 +)} 4 분 200g에서 다시 centrifuged 다음합니다. 이것은 두 번 수행되어야합니다.
4. 세척 후, 세포를 그 다음 10 분 동안 상온에서 1mL 4 %의 paraformaldehyde (PFA)에 다시 보류 그들에 의해 해결됩니다.
5. 전지는 PBS의 1mL와 함께 두 번 다시 씻어 ​​있습니다 -.
6. 로 세척, 블록 전지 후 다시 정지 차단 솔루션 1mL (6 % serum/94 % PBS -)에 있습니다. 45 분 동안 실온에서 이들을 품어.
7. 후, 4 분 200g에 튜브를 원심 분리기 및 차단 솔루션을 대기음. 기본 항체 용액 (권장 희석에서 차단 솔루션으로 만들어진)의 1mL의 세포를 다시 일시 중지합니다. 세포 중 1 시간 또는 4 ° C 하룻밤 다음 단계를 진행하기 전에 실온에서 incubated 수 있습니다.
8. 전지는 다음 블록 솔루션 1mL로 두 번 씻어 있습니다.
9. 차 항체 용액 (권장 희석에서 차단 솔루션을 만든)과 1 시간 동안 실온에서 품어의 1mL에 다시 정지 세포, 후.
10. 일시간 후, 세포를 그 다음 블록 솔루션 1mL와 함께 두 번 다시 세탁해야합니다.
11. 차단 솔루션과 함께 세척 후, PBS의 1mL로 다시 세포를 씻어 -.
12. 다양한 세척 후의 1mL의 세포를 다시 중단 DAPI 핵 얼룩 (PBS에서 DAPI의 1:10,000 희석 -) 5 분 실온에서 알을 품다.
13. 5 분 후에, 4 분 200g에 튜브를 원심 분리기. - PBS의 1mL의 DAPI 핵 얼룩 솔루션과 다시 중단 세포를 대기음.

2 부 : cytospin 장치를 통해 생성된 슬라이드의 hPSCs의 설립

1. 플라스틱 슬라이드는 드릴 프레스와 그들의 구멍에서 원하는 금액을하여 준비가되어 있습니다. 직경 사용할 micropipette 팁 (들)의 넓은 직경보다 가장 큰 1mm에서해야합니다.
2. 필터 페이퍼는 가위로 플라스틱 슬라이드의 매개 변수로 절단됩니다.
3. 구멍은 다음 여과지에 만들어집니다. 구멍의 크기 (들) micropipette 팁 (S)는 그것을 통해 snuggly 맞는 충분히 커야합니다.
4. 후 준비 플라스틱 슬라이드 중 하나는 상단과 컷 필터 용지 (그림 1)의 하단에 위치에있는 유리 슬라이드에 배치됩니다. 레이어는 테이프로 안전하고 있습니다.
5. 파트 1에서 스테인드 세포 현탁액의 100μL의 최대 (원하는 monolayer 밀도에 따라 다름) 다음 micropipette 팁 (들)의 상단에 배치됩니다.
6. 필요한 경우, 셀 솔루션기구는 무게와 유사한 체중의 카운터 - 균형을 만들 수 있습니다.
7. cytospin 장치 및 카운터 - 균형은 다음 바탕 화면 원심 분리기에 배치 4 분 200g에 centrifuged 아르 수 있습니다.
8. 원심 분리 후, cytospin 장치는 신중하게 유리 슬라이드에서 세포를 이동시키다 나던 방법으로 분해됩니다.
9. 필요한 경우, 초과 주변 PBS - 유리쪽에에 밖으로 aspirated.
10. 세포는 다음 원하는 세포 monolayer가 달성되었는지 확인하기 위해 형광 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다.

파트 3 : 슬라이드 마운트

1. 원하는 설치 미디어의 방울이 세포를 포함하는 각 지역의 중심에 직접 저장됩니다.
2. 후 커버 슬립이 부드럽게 가능한 경우 기포를 피하려고 슬라이드로 저하됩니다.
3. 초과 설치 미디어는 다음 슬라이드에서 제거됩니다.
4. 후, 커버 전표의 측면​​은 손톱 바니와 함께 봉인하고 있습니다.
5. 결과가 관찰하고 설명하는 때까지 슬라이드는 어두운 저장 영역에 보관하실 수 있습니다.

토론

우리 연구소의 목적을 위해, 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEFs)에 성장 줄기 세포 문화 35mm 요리가 cytospin 장치와 함께 사용하기위한 immunocytochemical 얼룩 절차에 할당된 것입니다. 세포는 다음 단일 세포 현탁액에, 가능한 한 MEF 층의 제거, passaging 효소에 의해 수집됩니다. MEF 계층에서 더 효과적으로 줄기 세포 격리가 필요한 경우, 식민지를 수동으로 정지에 소화 다음 포착 수 있습니다. 피더 무료 조건은 줄기 세포의 문화를 성장에서 사용하는 경우, 식민지 단순히 긁어 냈 및 정지로 소화 수 있습니다. 초기 단일 세포 현탁액 이상적이지만, 모든 세포 대단히 짧은 시간은 효과적으로 immunocytochemical 얼룩 프로 시저에 대한 호출 수많은 세탁 다시 정지 단계에 걸쳐 분해해야합니다.

동영상은 얼룩의 hPSCs에 대한 세포 마커의 사용에 초점을 맞추었습니다. hPSCs의 세포내 얼룩이 원하는 경우, 차단 솔루션의 추가하기 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Lab Tek Permanox 챔버 슬라이드	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	재사용 플라스틱 슬라이드용 재료
Superfrost/Plus 현미경 슬라이드 사전 청소	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μ L 필터 팁	미국 과학, Inc.	1121-3810
현미경 커버 유리	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	마운팅 매체
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Normal Goat Serum	Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody	EMD Millipore		MAB4304 SSEA-4 염색을 위한 1차 항체
Rat Anti-SSEA-3, 단클론 항체	EMD, Millipore	MAB4303	SSEA-3 염색을 위한 1차 항체
Alexa Fluor 488, Goat Anti-Mouse,	Invitrogen	A11029	SSEA-4 염색을 위한 2차 항체
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG	, Invitrogen	A11006	SSEA-3 염색
을 위한 2차 항체DAPI, 디하이드로클로라이드	칼바이오켐	268298