Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
배아 상피 세포가 여러 세포 조직은 이러한 세포 표면적과 셀 높이의 변화로 자신의 형상의 변화를 받아야 어디 morphogenesis을 연구하는 이상적인 모델 역할을하고, 세포가 유사 분열을 받아야하고 마이 그 레이션하는 곳. 또한 상피 세포는 인접한 조직에 morphogenetic 움직임을 통제할 수
프로토콜
당신이 시작하기 전에
- 표준 방법 (; Epicentre의 Biotechnologies, 매디슨 위스콘신 AmpliCap의 전송 키트)의 찬란 태그 단백질과 정화 mRNA를 인코딩 선형 DNA의 템플릿에서 덮인 mRNA를 합성. mRNA는 0.2 ML의 원심 분리기 튜브의 단일 시간 사용 aliquoted 및 -80 ° C.에 보관해야
- 표준 체외의 수정에 계란을 얻는 방법, 그리고 계란 코트의 제거는 이전에 다음이 설명되었습니다. Xenopus laevis 여성 개구리의 알을 얻기 위해 절차는 이전 세 증명되었습니다. 남자 개구리에서 이전에 분리된 testes를 사용하는 여성 개구리에서 그들을 구하기 후 즉시 체외에서 계란을 비옥. 데 - 젤리 달걀은 20 분 게시물 수정과 mRNA, 단백질, DNA, 또는 dextran을 주입 즉시 microinjected 시약의 충분한 보급을 허용합니다. 주사 이상 1 시간 게시물의 수정은 종종 사출 사이트에서 주워 실패합니다.
- Oocyte의 microinjection은 압력 밸브 제어 연료 분사 장치를 (PLI - 100, 하버드 장치)를 사용하여 이전 4 입증되....
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토론
우리는 혀끝의 세포 피질 및 Xenopus의 배아에서 상피 세포의 세포 세포막을 진동의 이미지를 동적으로 변화하는 cytoskeleton에 우리가 실험실에서 정기적으로 사용되는 실험 프로토콜을 제시했습니다. 이 프로토콜의 최적화 필수적이며, 설정 중 일부는 현미경 시스템을 하나의 유형에 따라 변경됩니다 있으며 단백질 하나의 타입은 이미지에 관심이있다, 하나는 상피 세포 모양의 라이브 영상을위한 출발점으로이 프로토콜을 사용해야합니다 . 함께, 프로토콜 단계 (explant 절연, 이미징 및 시각화 휴대폰과 하위 세포 구성 요소의, 그리고 부량 방법론) 상피 morphogenesis 연구를 포괄적인 절차를 제공합니다.
기억에 중요한 측면
- 배아에 마이크로 사출을위한 고품질의 mRNA를 준비하는 것이 중요합니다. mRNA 튜브가 저하되지 않도록 얼음에 저장됩니다. 일단 테스트, 튜브가 -80에 저장된 ° C를 작은 aliquots 여러 동결 - 해동.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 국립 보건 연구소 (R01 - HD044750), 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 경력 부여, 그리고 미국 심장 협회 (보조금을 시작)의 지원에 의해 지원되었다. 분자 생물학과 합성 mRNA 그녀의 도움 HY 김, M. 폰 Dassow 및 J. 만주국 (매일 연구실 책임에 대한 도움), 그리고 린 장 : 저자 데이비슨 연구소 회원 주셔서 감사합니다. 우리는 지난 몇 년 동안 다양한 방법을 개발하고 테스트하여,이 프로토콜의 일부에 기여한 모든 개구리 실험실 (특히 레이 켈러의 더그 DeSimone의)에서 실험적인 노력을 인정합니다. 우리는 각각 멤 - GFP 및 moesin - GFP의 plasmids 그들의 종류의 선물 리차드 할랜드와 존 월링포드 감사드립니다.
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참고문헌
- Ninomiya, H., Winklbauer, R. Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension. Nat Cell Biol. 10 (1), 61-61 (2008).
- Kay, B. K., Peng, H. B. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1991).
- Cross, M. K., Powers, M.
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재인쇄 및 허가
