헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

Summary

이 문서는 제대로 BioRad는 양파 표피 세포에 플라스미드 DNA을 소개하는 진 건 헬리 우스 및 Bimolecular 형광 Complementation의 원칙 (BiFC)를 기반으로 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 테스트를 사용하는 방법을 보여줍니다

Abstract

다양한 생물의 유전자 기능을 조사 유전자 제품들이 정상 세포 환경에서 서로 상호 작용하는 방법에 대한 지식에 의존하고 있습니다. Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

Protocol

I. 플라스미드 준비

폭격에 사용되는 플라스미드 DNA는 고순도 및 500ng/μl 이상의 농도에 있어야합니다. BiFC 두 플라스미드 구조를 포함한 각 플라스미드 25 μg이 필요합니다. 즉, 두 plasmids의 1시 1분 어금니 비율은 카트리지의 준비 50 μg 총 플라스미드 DNA을 일으키다로 혼합한다. 50 μg 이상의 DNA를 추가하면 황금 입자의 응집을 일으킬 수 있으며 피해야한다고 염두 수 있습니다. 상용 플라스미드 DNA 추출 키트 플라스미드 DNAs를 분리 권장됩니다.

플라스미드 벡터는 pUC19와 같은 크기가 비교적 작은되어야합니다. 우리는 겁쟁이와 LUH 각각 ³ pUC19 - SPYNE와 pUC19 - SPYCE로 cDNA를 복제. Agrobacterium - 중재 변환에 대한 바이너리 벡터가 너무 큽니다과 폭격에 대한 부적 절한 있습니다.

II. 카트리지 준비

카트리지 준비는 플라스미드 DNA와 이후 유전자 총 카트리지 홀더에 로드할 수 있습니다 이분의 일 인치 긴 조각으로 절단 플라스틱 튜브로 그들을 로딩과 코팅 골드 입자를 포함한....

Discussion

1. : GFP 또는 35S : : : 거스 처음 사용자를 위해, 우리는 35S와 같은 하나의 플라스미드 제정 기자와 카트리지 준비에서 관찰하는 전체 절차를 연습하는 것이 좋습니다. 우리는 35S 사용 : 플라스미드 GFP는 DRS 얻은. 스티브 마운트 및 Xiaoning 장 ⁶ (그림 1A, D). RioRad (CAT 165-2244)에서 판매하고 유전자 촬영 제어 카트리지 공장에 적합하지 않습니다.
2. BiFC 들어, 두 번째 긍정적인 제어가 각각 YFP의 C - 터미널과 N - 터미널 조각 융합이 알려진 상호 작용하는 파트너로 구성해야하는, 필요합니다.
3. BiFC 들어, 몇 가지 부정적인 컨트롤을 포함하는 것이 필요합니다 : (1) 단백질의 X는 YFP의 N - 터미널 조각 플러스 C - 말단 조각에 대한 코딩 벡터로 융합, (2) 단백질 Y가의 C - 말단 조각을 융합 YFP 플러스 N - 말단 조각에 대한 코딩 벡터는, 전용 (3) 벡터.
4. 조직 손상을 줄이기 위해 제공하는 기회를 발.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
노란 양파	모든 공급 업체
Helios Gene Gun	Bio-Rad
Zeiss, Nikon, Olympus			에 적합한 필터가 있는 형광 현미경