다음 프로토콜은 가상 슬라이스 이미지에 대한 췌장 해부 과정을 설명하고, 전체 췌장에있는 모든 GFP - 태그 베타 세포의 후속 부량.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
건강과 질병의 특정 세포 인구의 변화를 추적하는 것은 생명 의학 연구의 중요한 목표입니다. 모니터링 췌장 베타 세포 증식과 아일릿 성장의 과정은 특히 도전이다. 우리는 ImageJ (rsb.info.nih.gov / 엘제이 /)에 대해 작성된 매크로와 형광 - 태그 베타 세포와 유전자 변형 생쥐의 췌장 손상에서 베타 세포의 분포를 캡처하는 방법을 개발했습니다. 췌장 해부 및 조직 삭제에 따라, 전체 췌장은 어떤 후 GFP - 태그 베타 세포 검사 있으며, 가상의 슬라이스로 캡처합니다. 분석 총 베타 세포 지역 아일릿 번호 및 각 아일릿과 베타 세포의 작은 클러스터에 대한 특정 매개 변수와 위치에 대한 참조와 크기 분포의 부량을 포함합니다. 아일 레츠의 전체 분포는 3 차원에 역모를, 각 아일릿의 크기와 모양에 대한 배포의 정보를 한 눈에 전체 베타 세포 분야에서 변화의 양적 및 질적 비교를 허용하실 수 있습니다.
프로토콜
1 부 : 표본의 준비
- 해부 현미경 아래에 마우스를 놓고 여전히 첨부된 십이지장과 비장과 함께 전체 췌장을 제거하고 미리 무게 유리 슬라이드에 장기 장소. 그것은 췌장에 바인딩된 어디 측면을 따라 자사의 결합 조직을 절단하여 십이지장을 제거합니다. 췌장이 완전히 슬라이드에 고립된 때까지 췌장에있는 비장과 여분의 지방을 잘라 제거합니다. (췌장 지방은 췌장 조직의 약간 어두운 컬러와 태너에서 차별은 흰색 색상에 의해 구분됩니다.)
- 그것이 완전히 적용되도록 췌장을 통해, coverslip을 (표준 커버 유리 25x75mm 50x75mm 대형 커버 유리) 놓습니다. 슬라이드와 커버 사이의 췌장을 버리고 무게 (무거운 책을 예)를 사용합니다. 췌장을 평평화, 무게에 따라하면 약 5 분이 걸립니다.
- 무게를 벗어. 췌장은 슬라이드에 대해 잘 평평 경우 4 ° C 하룻밤에 4 % paraformaldehyde (PFA)에 놓으십시오. 아침에 coverslips을 제거하고 잘 날 (6~8시간) 동안 PFA로 전체 췌장을 폭로. 췌장이 잘 고정되지 않을 경우, 그것이 더 이상 PFA에 남아 아마도 하룻밤 수 있습니다. 1퍼센트로 컨테이너에 슬라이드를 전송 튼과 인산염의 X - 100 (PBS) 야간 호수 버퍼. 그 다음날, 1-2 일 동안 포화 자당의....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
손상 췌장에서 아일 레츠와 베타 세포 클러스터의 가상 슬라이스 이미지의 분석 아일 레츠의 전체 분포의 대규모보기를 제공합니다. 개발 및 시간이 지남에 따라 전체 아일릿 분포의 변화에 따라서 공부하고 비교할 수 있습니다. 이러한 예제는 췌장 아일릿 형성 (1) 우리의 분석에 증명됩니다. 여러 시간 지점 (P1 - P21)에서 신생아 쥐 pancreata의 포괄적인 분석 아일 레츠는 분열에 의해 형성되는 것을 보여주었다. 베타 세포 증식은 P1 - P10에서 마우스의 lognormal 확률 밀도 함수와 부합하지만, P12 이후부터 아일릿 배포는 분열의 과정을 제안, 왼편쪽에 떨어진 lognormal에서 사라지는. 유사한 분석은 진보적 피크 위치와 X 축 스케일의 매개 변수 lognormal 기능을 장착 마우스의 insulinoma 개발, 그리고 전원 법 배포 (2)에서 수행되었습니다
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
연구는에서 지원하는 미국 보건 서비스 그랜트 DK - 081527, DK - 072473 시카고 당뇨병 연구 및 교육 센터 (동물 모델 코어) 대학 및 Kovler 가족 재단에서 선물 DK - 20595.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 포셉 | Miltex Inc. | ||
| 가위 | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| 가위 | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| 대형 유리 슬라이드 | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| 대형 커버 글라스 | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| 유리 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| 커버 글라스 | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| 커버 글라스 | Erie Scientific | 25mm 원형 | |
| 형광 현미경 | Olympus Corporation | ||
| 해부 현미경 | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP 마우스 | Jackson Laboratory |
참고문헌
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
