에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

요약

정량 실시간 PCR (qRT - PCR)은 다른 곤충의 조직 및 발달 단계에서 mRNA 수준을 진단하는 효과적인 도구입니다. 이 보고서에서 우리는 다른 애벌레 조직에서 확인할 mRNA 레벨 및 침입 곤충의 종, 에메랄드 애쉬 송곳의 발달 단계에 qRT - PCR의 사용을 보여줍니다.

초록

에메랄드 애쉬 송곳 (EAB,

프로토콜

다른 단계를 완료 프로토콜은 그림 1의 플로우 차트에 그려져 있습니다. 절개를 구성 각 단계는, RNA 추출, 첫 스트랜드 cDNA 합성과 qRT - PCR은 아래 내용입니다.

I. 애벌레의 해부

1. 이 절차의 시작, 장소 에메랄드 애쉬 송곳 또는 EAB, 젖은 티슈에 애벌레하기 전에 해부이 수행되기 전까지는. 신선한 1X 인산염은 절개를 통해 버퍼 추위를 유지하는 얼음, 또는 PBS, 생리 버퍼 유지.
2. 시작하려면, 미세 절개 핀과 해부 접시에 EAB 애벌레를 수정. 그 다음 해부 접시에 차가운 1X PBS를 추가합니다.
3. 첫째, 해부 가위의 벌금 쌍을 함께 애벌레 목을 벨. 이후 애벌레의 마지막 복부 세그먼트를 제거합니다.
4. 포셉의 시계 제조인 쌍을 사용하여 애벌레 시체에서 표피를 리프트. 그런 다음 가위를 사용하여 시체의 길이를 따라 절개합니다. 절개가 만들어으로 파열 창자를 안됩니다.
5. 조심스럽게 등 지방 기관 및 결합 조직 등 다른 조직에서 midgut 조직을 분리. 그런 다음, fatbody에 대한 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 신선한 1X PBS 버퍼에있는 조직을 씻어. 1.5 ML eppendorf 튜브에 미리 냉장 Trizol 시약 500 ....

토론

임계값주기 (CT)이 값은 qRT - PCR 플레이트의 각 샘플에 대해 얻을 수 있습니다. 표준 곡선을 만들기위한 각 희석에 대해 얻은 CT 값은 그 농도의 로그 역모를 꾸몄다했다. 실험 샘플에 대한 CT 값은 다음이 희석 시리즈 표준 곡선에 꾸몄다했다. 목표 수량은 각 실험 즉, 조직 발달 표현에 대해 생성된 별도의 표준 곡선으로부터 계산되었다. 상대 표현식 값 (REVs) 다음 내부 통제를 위해 얻은 수량 (AP - RP1)와 관심의 대상 시퀀스의 수량을 (이 경우 AP - PERI1)를 나눔으로써 결정되었다. 중요성의 계산은 각 유전자에 대한 REVs의 로그는 SAS (SAS 연구소 주식 회사 SAS / STAT 사용자 안내서, 버전 9.1)의 PROC 혼합 절차를 사용하여 ANOVA (분산 분석)에 의해 분석되었다. 표현 수준에서 의의는 P <0.05로 결정되었다. 조직의 경우 상대 접어으로 변경되며, 변경된 사항은 캘리 브 레이터 (1X 샘플, Pfaffl, 200.......