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Summary

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Abstract

초기 척추의 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. zebrafish 배아, 모자이크 표현의 플라스미드 DNA 결과의 주입이 단일 세포 또는 세포의 작은 클러스터의 시각화에 대한 허용에¹. 우리는 유비 쿼터스 모터의 제어하에 플라스미드 DNA 인코딩 막 타겟 그린 형광 단백질 (mGFP)의 분사가 neurulation를 겪고 이미징 세포에 사용할 수있는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에 센트럴 섹션에 있으며, 실시간으로 고해상도의 영상 표시 세포에 대한 방법론이다. 이 프로토콜은 젊은 zebrafish의 배아에 mGFP의 DNA의 삽입을 알아볼 수 있습니다. 배아는 다음 vibratome sectioning, 항체 라벨과 공촛점 현미경으로 영상에 대한 처리됩니다. 또는 mGFP을 표현 라이브 배아는 시간이 경과 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 우리는 이전에 zebrafish 배아의 hindbrain 지역에서 신경 튜브 형성을 유발 세포 행동을 분석하는이 간단한 접근 방법을 사용했을². 라이브 영상은 neurulation 동안을 세포 역학의 이해를 가능하게이 방법을 보완하면서 고정 준비가 세포 모양과 신경 튜브 조직의 전례 시각화를위한있었습니다.

Protocol

1.Microinjection

1. 희석 플라스미드 인코딩 막 타겟 그린 형광 단백질 (mGFP, 리차드 할랜드의 호의) 40 NG / ML의 농도. DNA는 Qiagen의 맥시 준비 키트를 사용하여 정화 플라스미드 (리차드 할랜드의 mGFP/PCS2 +, 호의)를 linearizing으로 준비가되어 있습니다. 솔루션에 페놀 레드 (10분의 1 총 볼륨을 희석)의 추가는 솔루션을 시각화하는 것이 좋습니다. 얼음 DNA 솔루션을 유지.
2. 졸업 슬라이드에 바늘을 정렬하고 부드럽게 깨끗한 레이저를 사용하여 직경이 1μm는 바늘의 일부를 도청하여, stereomicroscope에서 주사 바늘을 (CAT 번호 NA – GD – 1 Narishinge 과학에서 90mm 유리 모세관) 보정 블레이드 (적절한 크기의 팁을 얻기 위해).
3. 알려진 볼륨 (2nl)을 삽입하기 위해 바늘을 보정하기 위해 microinjection 장치에 바늘을 연결 (PCI 100 Microinjector, 하버드 장치)와 앞에는 조각에 위치 페놀 레드와 물이 들어있는 솔루션 0.5μl으로 바늘을 기입 파라핀니다. 솔루션은 발을 페달을 사용하여 적절하게 사용하실 수 있습니다. 7 KPa로 압력을 설정하고 그것이 솔루션의 0.5μl 특면 250 페달 소요 있도록 (10msec 30msec) 시간을 달라집니다.
4. humidified 100mm 배양 접시에있는 왁스의 스트립에있는 눈금 바늘을 조심스럽게 넣습니다. 접시를 …을 축이다하려면, 가장자리 주위에 서부 유럽 표준시 Kimwipes를 (이것은 바늘에있는 솔루션의 증발을 방지) 장소.
5. 바늘 끝 (보정하지 않은 끝)에 DNA 0.5 – 1μl를로드 micropipette을 사용합니다.
6. 이 솔루션은 바늘 끝에 도달되면, microinjection 장치에 로딩에 사용했던 바늘의 끝을 연결합니다. 발 페달을 사용하여 약 2 NL / 주사를 제공하기 위해 microinjector에 대한 설정을 조정합니다.
7. 엠브료 매체 (1.0 ML 행크의 주식 # 1, 0.1 ML 행크의 주식 # 2, 1.0 ML 행크의 주식 # 4, 95.9 ML ddH ₂ O, 1.0 ML 행크의 주식 # 5 가득한 페트리 접시의 중앙에 다음 위치 zebrafish의 배아 , 1.0 ML 신선한 행크의 주식 # 6, 산도 7.2-10 방울 1 M NaOH에 대한 사용).
8. 태아가 원하는 단계로 개발한 후, 부드럽게 잘 포셉로 chorion를 손잡이 및 사출을위한 대상 지역에 바늘을 …을 놓다. 넓은 범위 mGFP 표현은 1cell 단계에서 노른자 또는 세포질로 DNA를 주입. , 작은 지역에 mGFP 표현을 제한하는 하나의 세포의 세포질에 4 (이상) 세포 단계에서 DNA를 주입합니다.
9. microinjection 장치의 발을 페달을 누르면 약 2 NL을 제공, 솔루션 (페놀 레드의 추가로 인해 가시)가 제대로 분사는 것을 보장.
10. 조심스럽게 배아에서 바늘을 제거합니다.
11. 배양 접시에있는 모든 배아에 대해 반복합니다.
12. 배아는 28.5에서 원하는 단계 ° C를 개발하도록 허용합니다.
13. 부드럽게 잘 포셉을 (배아는 배아의 생존율을 증가 유리 페트리 접시에 dechorionating, 24hpf 미만 경우)를 사용하여 chorion를 벗겨내하여 Dechorionate 배아.
14. 유리 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 빈 chorion를 제거합니다.

2. 이미징 mGFP – 표시 vibratome 섹션

1. 1X 인산 버퍼 용액 (PBS)에 정착액 (4 % paraformaldehyde로 배아의 수송을 유리 피펫을 사용합니다. 4 ° C 하룻밤에 배아를 수정.
2. 오분 각 1X PBS에서 배아 3 번 씻으십시오.
3. 페트리 접시, 그리고 좋은 집게를 사용하여 배아를 놓고, 배아를 손상시키지 않고 노른자를 제거합니다. 가능한 많은 노른자를 제거합니다.
4. H ₂ O.에서 4% 낮은 용융 아가로 오스 준비
5. 플라스틱 금형에 sectioning 플레이스 녹은 아가로 오스합니다.
6. 페트리 접시에서 주입된 배아를 리프트와 아가로 오스의 장소와 방향을 잘 집게를 사용하십시오. 배아는 주형의 한쪽 끝을 향해 배치되어야합니다.
7. 아가로 오스가 강화된되면, 금형의 아가로 오스 블록을 제거하는 등 주걱 같은 평평한 도구를 사용합니다.
8. 그것도되도록 면도날와 아가로 오스 블록의 아래쪽 끝부분을 잘라 버릴거야.
9. vibratome 무대 슈퍼 접착제 한 방울을 추가하고 그것에있는 아가로 오스 블록 (면도칼로 안정되었다 블록의 측면이 접착제에 직면한다)를 놓으십시오. 여러 개의 배아를 sectioning 들어, 무대에서 여러 아가로 오스 – 임베디드 표본을 탑재합니다.
10. (Vibratome 주식 회사) vibratome에 vibratome 무대를 연결합니다.
11. (:; 두께 – 50μm 속도 – 3 일반 설정) vibratome의 매개 변수를 설정합니다. 여러 개의 배아를 sectioning 경우, 무대 아가로 오스 블록을 정렬하고 (같은 배아에 해당하는 섹션이 함께 남아있게됩니다 것과 같은)으로 날개가 아가로 오스 블록의 전체 너비를 통해 전체 배아 통해 이뤄지는 아니지만되었는지 확인합니다.
12. vibratome 단계 1X PBS 하거라.
13. 섹션을 참조하십시오.
14. 일단 배아가 sectio입니다네드, vibratome 단계에서 아가로 오스 블록 (들)을 제거합니다.
15. 조심스럽게 아가로 오스 블록 (S)의 뒷면을 절단하여 각 섹션을 구분합니다.
16. 1X PBS – 채워진 멀티 잘 요리 (다른 배아에 해당하는 부분에 대해 서로 다른 우물을 사용)로 원하는 섹션과 장소를 선택하는 미세 집게를 사용하십시오.
17. 각각의 배아에 대해 반복합니다.
18. 항체 라벨을 진행, mGFP 영상 (섹션이 준비 하루 이틀 내에 몇 군데있다면이 단계가 필요하지 않을 수 있습니다) 향상시키기 위해, 23 불구하고 19 단계를 반복합니다.
19. 비 특정 바인딩을 차단하는 1X PBS에 차단 솔루션으로 실온에서 30 분 섹션을 처리합니다.
20. 기본 항체 (토끼 – GFP, Invitrogen 캣 번호 A11122) 4에서 5 상온에서 시간 또는 하루에 쉐이크에 차단 솔루션 @ 1:200 희석 ° C.와 함께 품어 섹션
21. 1% BSA/1X PBS / 1퍼센트 DMSO 용액에서 네 번 (10 분, 15 분, 30 분 및 60 분 각) 씻으십시오.
22. 4 5 상온에서 시간 또는 숙박에 대해 차단 솔루션에 적절한 보조 항체와 섹션을 처리 ° C.
23. 1% BSA/1X PBS / 1퍼센트 DMSO 용액에서 네 번 (10 분, 15 분, 30 분 및 60 분 각) 씻으십시오.
24. 핵을 얼룩이 30 분에 대해, DAPI (Invitrogen 고양이 번호 D1306 50ml 1X PBS에 0.​​1 %의 DAPI)와 섹션을 처리합니다.
25. 오분 각 1X PBS로 세 번 씻으십시오.
26. 슬라이드에 마운트합니다.
27. 공촛점 현미경을 사용하여 이미지.

3. 라이브 영상

1. 그들은 원하는 발달 단계에 도달 Dechorionate 살고 주입 배아 삼십분 전에. 15 분 대한 진정 솔루션의 배아 (0.01 % 엠브료 매체 Tricaine)을 놓으십시오.
2. (; 부품 번호 P35G – O – 20 – C MatTek) 35mm 유리 바닥 문화 요리에 1% 아가로 오스의 드롭 놓습니다.
3. 아가로 오스는 응고 수 있습니다.
4. 아가로 오스 3 구멍 (예 : micropipette 팁 같은 다른 개체가 구멍을 만드는 데 사용할 수 있습니다)을 만들기 위해 화염을 통해 열 모세관. 여운 아가로 오스는 구멍 바닥에 없습니다 있는지 확인하십시오.
5. 엠브료 매체와 페트리 접시를 입력합니다.
6. 구멍에서 배아를 배치 유리 피펫을 사용합니다.
7. 다음 방향이 지역 (지느러미 머리) 몇 군데 수 있도록 좋은 집게를 사용하여 난자는 유리와 접촉하고 있습니다.
8. 조심스럽게 현미경 스테이지 (증발을 방지하기 위해 페트리 접시 위에 뚜껑을 장소)에 페트리 접시를 전송.
9. 이미징 동안 배아는 28.5 ° C.에 있는지 확인하십시오

4. 검색 결과

우리는 여기서 모자이크 표현을 사용하여 zebrafish 신경 튜브의 이미지를 하나의 세포에 대한 직접적인 접근 방식을 설명합니다. zebrafish 배아의 광학 투명도에도 불구하고, 우리는 신경 세포의 시각화가 크게 vibratome를 사용하여 얻은 크로스 섹션에 향상된 것으로 나타났습니다. 이 섹션 공촛점 현미경을 사용하여 다른 초점 비행기에서 특정 세포에서 세포 이미징을위한 연장 허용 (50 ㎜) 두께입니다. 이 방법론을 사용하는 결과는 ^다른이 출판되어 있지만, WT 배아 (그림 1)과 N – cadherin (N – CAD)의 신경 튜브에 세포의 대표 이미지는 돌연변이 (그림 2)이 제공됩니다. 후자는 돌연변이 정중선 (그림 2)을 향해 제대로 방향에 실패 N – CAD에 신경 접시의 측면 지역에 세포를 보여줍니다. 이 모자이크 라벨과는 달리, 이러한 베타 catenin과 같은 일반적인 세​​포 표면 마커와 neuroepithelium을 immunostaining하면 각각의 세포의 형태는 (그림 3) 시각을 허용하지 않습니다.

라이브 배아의 시간 저속 영상은 neurulation 동안을 세포 역학의 이해를 가능하게 고정 표본의 모자이크 라벨을 보완. 영화 1 WT 세포가 적극적으로 medially 지향 막 라고나할까요을 확장하여 정중선으로 마이 그 레이션하는 것으로 나타났다.

WT zebrafish 배아의 신경 튜브 그림 1. mGFP 표현.

N – cadherin zebrafish 배아의 신경 튜브 그림 2. mGFP 표현.

neuroepithelium 그림 3. B – catenin 단백질의 얼룩.

Discussion

결론적으로, 분류 기술은 zebrafish 배아에 morphogenetic 프로세스의 단일 세포 분석을위한 수 있도록 여기에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 주요 강조는 유비 쿼터스 모터의 제어하에 mGFP을 사용하여 신경 튜브의 영상 표시 전지 방식에 있습니다. 이 과도 표현 분석 독자의 추가 어플 리케이션을위한 안데르센 외의 최근 논문을 참조해야합니다. ^3.

Materials

<p class="jove_title">Solutions</p>

<ul> <li>Hank's Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H<sub>2</sub>O</li> <li>Hank's Stock #2: 0.358 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> Anhydrous, 0.60 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> in 100 ml ddH<sub>2</sub>O</li> <li>Hank's Stock #4: 0.72 g CaCl<sub>2</sub> in 50 ml ddH<sub>2</sub>O</li> <li>Hank's Stock #5: 1.23 g MgSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O in 50 ml dd H<sub>2</sub>O</li> <li>1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3</li> <li>Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)</li> </ul>