이미징 CA의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링

요약

자극 - evoked [칼슘 ^{2 +} 개별 인간의 정자] 나는 신호를 평가하고 있습니다. 운동성이있는 세포는 칼슘과 함께로드됩니다 ^{2 +} 구분 형광 염료 (AM - 에스테르 방법) 및 perfusable 챔버에 고정. 세포는 시간이 경과 형광 현미경으로 몇 군데와 perfusing 매체를 통해 자극하고 있습니다. 하나의 세포 (또는 지역)의 응답은 Excel을 사용하여 오프라인 분석하고 있습니다.

초록

형광등, CA 탑재 세포의 형광 현미경

프로토콜

정상적인 정액 분석과 건강한 비옥한 남성의 정자는 일반적으로 다음과 같은 이미지 준비하고 있습니다.

1. 정액 샘플은 더 이상 30 분 37 ° C에 저장됩니다. 1.8 CaCl ₂ 0.2 H ₂ O, 5.37 KCl, 0.81 MgSO ₄ 0.7 H ₂ O, 26.2 NaHCO _3, 1.0 아니 ₂ PO ₄ : MM, 세포 보충 얼의 균형 소금 솔루션 (sEBSS에까지 수영을하여 정액 플라즈마에서 격리됩니다. 2 시간 ₂ O, NaCl 116.4, 55.6 D - 글루코오스, 2.73 나의 pyruvate, 41.8 나의 락트 산)은 0.3 % 숯 de-lipidated/fatty 산성 무료 분수 V BSA (BSA의 품질은 정자의 성공 capacitation 중요합니다)과 보완. sEBBS 1 ML 5 ML 튜브 일련의 각각에 pipetted 부드럽게 정액의 0.3 ML로 underlayered 있습니다. 상단 0.7 ML이 부드럽게 각 튜브에서 제거하고 풀링됩니다.; 1시간 (6 % CO _2가 37 ° C)에 대한 부화 후 정자 정지 10 μl가 세포를 고정하기 위해 포르말린 1% (V / V) 90 μl에 희석되어 그 정자는 노이 바 우어 챔버에 포함됩니다. 서스펜션의 셀 밀도는 다음 6,000,000 세포 / ML로 (sEBSS)를 조정됩니다.
2. 5-6 H 위해 capacitation 수 있습니다.; 예제는 다음 느슨하게 덮인 튜브와 incubated (6 % CO ₂ 37 ° C)는 200 μl의 aliquots으로 나뉘어져 있습니다
3. Coverslips (22x50 mm)는 이전에 폴리 - D - 라이신과 함께 취급하고 있습니다. 폴리 - D - 라이신 용액 (10 % W / V) 10 μl는 coverslip의 중심에 작은 방울의 숫자로 적용됩니다. 폴리 - D - 라이신은 다음 건조 공기를 허용됩니다. 이것은 가열 무대에서 수 있으며 건조를 완료해야합니다. . 워너 RC20 챔버와 비슷한 폴리 - D - 라이신 -; coverslip는 동봉된, 목적 - 건설, perfusable, 폴리 카보 네이트 이미징 챔버 (≈ 180 μl 용량 크기 35mm X 20mm X 5mm)를하기 위해 진공 그리스와 함께 첨부되어 있습니다 코팅 coverslip은 세포가 거꾸로 현미경에서 볼 수 있으며 12mm 직경 원형 coverslip 빛의 전송을 허용, 챔버의 상부 표면을 형성하는 챔버의 기초를 형성합니다.
4. 오레곤 그린 BAPTA1 - AM (OGB) 또는 칼슘 그린 1 - AM은 세포를 라벨에 사용됩니다. OGB은 DMSO에 용해에 의해 준비가되어 있습니다. Pluronic F127은 산성 (세제) 염료의 'clumping'을 방지하기 위해 DMSO에 포함되어 있습니다. 이것은 실험실 (0.5 ML DMSO 100 MG의 Pluronic)에서 준비할 수, 즉시 사용하기 전에, 또는 미리 준비를 구입할 수 있습니다. 20 μl는 OGB (2.5 MG / ML)의 50 μg의 나누어지는에 추가됩니다. 유리병은 다음 동결하고 나중에 사용하기 위해 해동 저장할 수 있습니다.
5. 정자의 capacitation 후 (sEBBS에 5-6 H, 37 ° C, 6 % CO ₂₎ 튜브가 이미징 및 OGB 솔루션 1.2 μl를 위해 선택되어이 10 μm의의 최종 농도를 제공, 추가됩니다. 튜브는 다음 세포 현탁액이 부드럽게 P1000 (파란색) 피펫 팁과 이미징 챔버의 유입 포트에 주입되는 후, 추가로 40 분 incubated입니다. 챔버 20 분, 아래 보육, 폴리 - D - 라이신 - 코팅 coverslip 측면에 배치됩니다. 세포는 챔버의 표면을 따라 수영하는 경향과 폴리 - D - 라이신 - 코팅 영역을 준수합니다.
6. 챔버 이제 재관류 장치에 연결되어 약 0.5 ML / 분 perfused, 현미경에 장착됩니다. 롤러 펌프 출구 포트에서 챔버 및 오버플로 생리가 함정과 흡입 펌프에 의해 제거됩니다 피드. 느슨한 세포와​​ 세포외 염료는 챔버의 재관류에 의해 제거 반면 준비는 적어도 10 분 동안 짙은 어둠 속에서 남아 있습니다. 온도 안정성 작은 변동은 세포 칼슘 ^{2 +} 항상성에 영향을 미치지 않을 수도 있기 때문에 결정적인 중요하지만 또한 염료의 K _{D에 영향을 줄} 수 있습니다. 실험은 일반적으로 25 수행됩니다 ° C,이 수준의 어두운 방의 온도를 유지하여 달성했습니다. 우리는 필요한 수준의 실내 온도를 유지하는 것은 온도 조절 단계 또는 호수 유입에 thermostatically 제어 히터를 사용하여보다 온도와 초점 안정성을 제공하는 것으로 확인되었습니다.
7. 전지는 위상 대비 (40x 또는 기름 침지 60x) 목적 및 이미징을위한 영역이 선택에 따라 볼 수 있습니다. 생리 흐름 판상하고 일관성이 어디 입구 포트 근처에있는 폴리 - D - 라이신 코팅 영역의 부분은 좋습니다. 세포 밀도가 적절한 영역을 사용하는 것도 중요합니다 (과도한 밀도는 인접한 세포에서 신호의 픽업을 통해 데이터의 품질과 무결성에 영향을)과 세포가 적절하게 연결되어 있지만 flagellar 활동이보고 알 수있는입니다. 위상 콘트라스트 이미지가 저장됩니다. 시간이 명확한 형광 이미지를 (일반적으로 50-200 MS) 취득에 필요한 최소한으로 감소 및 노출, 현미경은 다음 형광 모드 (방출 540 nm의 여기 480 NM)로 전환됩니다.
8. 실험은 시간 시리즈 이미지 수집 소프트웨어 (IQ)를 활성화하여 시작합니다. 일반적으로 이미지는 0.1 Hz에서에서 취득하고 조명은 softwa를 사용하여 이미지 수집의 기간으로 제한됩니다제어 셔터를 다시. 훨씬 더 이미지 수집 요금을 사용할 수 있지만 수당은 표백의 문제와 세포 (토론 참조) 사진 손상에 의한 유물 세대하셔야합니다. IQ (및 대부분의 다른 수집 소프트웨어 플랫폼) 실험 중 형광 실시간 그래프를 허용합니다.
9. 3~5분 기간 염분 성분의 조작 (예 : [칼슘 ^{2 +]} _O) 및 약물의 응용 프로그램의 제어 기간 후 재관류 헤더에 호수의 교체에 의해 이루어진다. 각 자극의 이외의 시간은 이미징 챔버 도착의 시간이 느리게 응답 (0.1 Hz에서에서 샘플) 여기에 설명된 평가에 대한 충분한 정확도를 제공하는 계산 수 있도록 기록됩니다. 더 빠른 응답보다 정확도가로 워너 RC20 챔버에서 제공하는 두 번째 유입 포트를 통해 직접 생리 흐름에 자극을 추가하여 얻을 수 있습니다.
10. 이미지 IQ를 사용하여 오프라인 분석하고 있습니다. (이자 (로아)의 영역은 각각의 셀 (또는 셀의 일부) 원형 그려되고 또한 세포 자유 구역은 소프트웨어 (자동 배경 제거를 위해 선택됩니다. 이미지 시리즈는 다음 acrosome 반응을 사망 또는 받았습니다 세포를 제거하는 검사 이것은 실험과 시계열로 분석하면 아티팩트를 일으킬 수있는 충분한 운동을 보여주었다 그 동안 세포질 염색의 손실) 형광 다음에 크고 급속한 증가로 나타납니다.
11. 시간 형광 강도 시리즈는 다음 각 투자 수익 (ROI)에 대한 취득하고 이러한 데이터는 Excel에서 오프라인 분석하고 있습니다. 처음에는 형광이 방정식을 사용하여 컨트롤 기간 동안 얻은 평균 값을 정규화는 R = [(FF _레스트) / F _휴식] X 100 %, R은 관리 기간에 비해 형광의 % 변화가 어디 있는지, F 형광 강도는 시간 T와 F의 _{나머지 부분에서} 제어 기간 동안 얻은 F의 최소 30 결정의 의미입니다.

대표 결과

그림 1은 세포가 3 μm의 제품 progesterone과 자극했다하는 실험에서 이미지의 일련을 보여줍니다. 상단과 영화 1 회색 규모의 형광 이미지를 표시하고 멋진 '색상 낮은 형광 강도를 나타내는 같은 mages'는 어디에 (이미지 J의 테이블 '16_colors 조회) 'pseudocolor에서 (그리고 영화 2) 다음과 같습니다 '따뜻한'색상 높은 형광 강도를 나타냅니다. 세포는 IQ의 조회 테이블을 사용하여 실험 도중 pseudocolor에서 볼지만, 그레이 스케일을 사용하는 것이 일반적 평가에 대한 더 유익합니다. 세포가 잘 표시 여부를하실 수 있습니다. 첫 번째 두 이미지 0 S 100 S 녹음 시작 후에서 수집된 있었다. 형광은 안정 및 게시물 acrosomal 영역과 정자의 목을 강하게하는 경향이 있습니다. Progesterone은 약 175 S에서 이미징 챔버를 입력하고 3 ^차 및 4 ^번째 이미지 (180 S와 220 S) ^[+ 칼슘 ^{2] I} (형광) 후부 머리와 세포의 목 지역에서 발생의 급속한 증가를 보여줍니다. 이후 이미지가 290에서 초기의 붕괴를 보여주는 360, 740, 990 및 1440 S입니다 [칼슘 ^{2 +]} 나는 과도하고 지속적인 보조 고도의 개발. 그림 2는 표준 형광 각 ROI (제어 기간에 비해 형광의 % 변화)에 대한 원료 형광 값을 변환, 스프레드 시트 분석을 보여주는 그림 3은 3 μm의의 progesterone의 '전형적인'반응을 보여주는 3 셀 시간 - 표준 형광 플롯을 보여줍니다.

그림 1. 전지에서 예제 데이터 progesterone과 자극. 그레이 스케일 (상단)와 pseudocolor (하단 행)의 형광 이미지의 일련 표시됩니다. 타임 포인트가 0, 180, 220, 290, 360과 990s입니다. 3 μm의의 progesterone은 175에서 이미징 챔버를 입력 S. 로아는 첫 번째 패널에 표시됩니다.

그림 2. Excel의 단일 세포 형광 데이터의 분석. 검은 수치 형광 데이터의 시계열 있으며, 수직으로 배열. 빨간색 숫자는 (아래)의 텍스트에서 주어진 방정식을 사용하여 얻은 정규화된 데이터입니다. 그래프는 자극에 따라, 작은 oscillations의 속도가 느린 상승 및 시리즈 다음 형광의 과도 상승을 보여주는이 실험에서 세포 64 표준 형광 시간 플롯을 보여줍니다.

그림 3. 3 각 세포에 대한 형광 시간 흔적이 가치를 제어에 관한 %의 변화로 표현 .. 3 μm의의 progesterone은 화살표로 표시된 시간에 추가되었습니다. 점선 프로그램은 제어 형광을 뜻합니다.

토론

성공적으로 수행되면,이 기술은 인간의 정자의 수 및 자발적인 유도 칼슘 ^{2 +} 신호의 배포 및 반응 속도론의 기록. 응답은 인간의 정자들이 자연과 칼슘 ^{2 +} 자극 신호의 변화를 많이 보여줄 수 있기 때문에 중요합니다 세포의 다수 (최대 200)에서 얻을 수 있습니다. 성공적인 분류 및 녹음하는 동안 세포의 생존은 샘플의 품질에 크게 의존하고 있습니다. 나쁨 샘플 가난한 라벨, 가난한 반응과 세포가 녹음 도중에 죽을 수도를 제공합니다.

인간의 정자는 사진 손상에 민감하고 따라서 세포의 생존을 극대화하고 세포를 파괴로 인해 유물을 최소화하기 위해 최소한의 필요한 조명 (강도와 노출 시간 모두)을 사용합니다. 카메라가 약한 형광을 데리러 때문에 높은 민감도 카메라 (낮은 강도 조명의 사용을 허용) 큰 도움이됩니다. 백 - 조명, EM - CCD 카메라는 매우 비싸지만, 특히 잘 적합합니다. LED 조명 (대신 여기 필터 크세논이나 수은 램프를 사용하여 또한 세포의 생존 (Nishigaki 외, 2006)을 향상시킵니다.

그것이 각각의 비율이 두 가지 이미지를 데리고 필요하기 때문에 Fura은 자외선과 여진을 필요로하고 있기 때문에 우리는 비율 - 메트 릭 영상의 명백한 이점에도 불구하고, Fura - 2를 사용하지 마십시오. 단일 파장, 가시 광선의 염료, 형광 강도의 정상화 주로 세포 사이에 염료를 로딩의 차이에 대한 보상, 아니라 개별 세포 내에 염료 배포하고, 이것을 염두에 부담하셔야와 함께 얻은 데이터. 단일 파장의 염료는, 원칙적으로 보정 수 있지만, 기술의 정확성이 떨어집니다 우리는이 작업을 수행하지 마십시오.

심지어 교정없이 Fura - 2 (또는 방출 비율 염색 인도)로 얻은 비율 데이터,의 상대 변화의 acceptably 충실 표현하다 반면에 [칼슘 ^{2 +]} I, 단일 파장 염료의 형광 강도는 훨씬 선형 출신 [칼슘 ^{2 +]} I. 관련 포화 곡선의 가장 유용한 부분 단일 파장 염료에 대한 관계는 일반적으로 로그에 대략. 우리는 현재 사용 오레곤 그린 BAPTA - 1 (그림 4)는 작은 변화에 민감하기 때문에 [칼슘 ^{2 +]} 나는 가까이 수준의 S (50-100 NM)을 쉬고 있습니다. 언제 [칼슘 ^{2 +]} 1 μm의 응답이 포화 수 있습니다 형광 변화와 염료의 관점에서 세 이하 대표한다 위 나 상승합니다. UV 여기에 resorting없이 기술 향상을 위해 옵션은 같은 Fluo - 3 및 Fura 빨강으로 염료와 부하 셀을 두 번하는 것입니다. 둘 다 488 NM에 흥분하지만, 동시에 그들의 반응은 매우 다릅니다 수 있습니다. 540 650 nm의에서 방출의 녹음의 정확한 모니터링을위한 더 나은 방법을 제공할 수있는 비율을 제공하는 [칼슘 ^{2 +]} I (Haughland, 2002)과 정자 (Nisigaki 외, 2006)에 적용할 수 있습니다.

그림 4. 오레곤 그린 BAPTA - 1과 오레곤 그린 BAPTA - 2 무료 [칼슘 ^{2 +]} (NM)와 피크 파장 (약 525 nm의)에서 형광 방출 간의 관계. OGB1 쉬고에서 높은 형광 제공 [칼슘 ^{2 +]} 그러므로하지만, 낮은 레벨에서 saturates 그리고이 작은 유용한 범위를하고 있습니다. 이러한 플롯에 대한 데이터는 분자 프로브 핸드북 (Haughland, 2002)에서 얻은되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
저조도 카메라	QImaging	Rolera XR
Oregon Green BAPTA-1	Invitrogen	06807
이미지 분석 소프트웨어	Andor	지능 지수
이미징 소프트웨어	미국 국립보건원	Image J	퍼블릭 도메인 소프트웨어
LED 조명 시스템	Cairn Research	Opto LED
Pluronic F-127 (DMSO 내 20% 용액)	Invitrogen	P3000MP