성인 초파리 뇌 장착: 컨포칼 이미징을 위한 슬라이드를 준비하는 방법

이 프로토콜은 Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌

1. 성인 D. melanogaster 뇌를 현미경 슬라이드 및 이미징에 장착

1. "브리지" 슬라이드를 만듭니다. 양전하를 띤 슬라이드에 두 개의 "베이스" 커버슬립을 약 1cm 간격으로 배치합니다. 슬라이드의 양전하를 띤 면이 위를 향하도록 하십시오. 그림 1A. 일반적으로 각 베이스 커버 슬립의 세 바깥쪽 가장자리를 손톱 광택제로 밀봉하여 장착 미디어가 이러한 베이스 커버 슬립 아래로 심지어지지 않도록 하는 것이 도움이 됩니다. 계속하기 전에 손톱 광택을 완전히 말리십시오(10 - 15분).
2. 슬라이드를 실체현미경 아래에 놓고 절개된 뇌가 포함된 장착 매체 용액을 두 커버슬립 사이의 공간에 피펫팅합니다. 더 많은 대비를 제공하려면 구즈넥 조명을 벤치 탑과 평행이 되도록 조작하는 것이 유용합니다.
3. 피펫을 사용하여 슬라이드에서 추가 장착 매체를 제거하고 슬라이드에서 브레인을 피펫으로 분리하지 않도록 주의하십시오.
4. 여분의 장착 미디어를 제거합니다. 이렇게 하면 다음 단계에서 뇌를 더 정확하게 배치할 수 있습니다.
5. 한 쌍의 집게와 실체 현미경을 사용하여 더듬이가 위를 향하도록 격자 패턴으로 슬라이드에 뇌를 배치합니다.
6. 뇌 위에 커버 슬립("브리지")을 놓습니다(그림 1A). 손톱 광택제를 사용하여 "베이스" 커버 슬립과 접촉하는 브리지 커버 슬립의 측면을 밀봉합니다.
7. p200 피펫을 사용하여 브리지 아래의 중앙 캐비티를 새 장착 매체(그림 1 B)로 천천히 채웁니다. 중앙 커버슬립의 열린 가장자리에 한 번에 한 방울씩 떨어뜨리고 장착 미디어가 중앙 브리지 커버슬립 아래로 심지가 가도록 합니다. 전체 캐비티가 장착 매체로 채워질 때까지 계속한 다음 투명한 손톱 광택제로 상단과 하단을 밀봉합니다.
8. 손톱 광택제가 마르면 즉시 슬라이드를 이미지화하거나 -20°C의 차광이 가능한 단단한 슬라이드 상자에 보관하십시오.
9. 일주일 이내에 여기 레이저와 선택한 형광 2차 항체에 적합한 필터 큐브가 있는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 뇌를 이미지화합니다. 버섯체 뉴런의 Z-stack 이미지는 일반적으로 20X 또는 40X 대물렌즈를 사용하여 얻을 수 있습니다. 망막 광수용체 뉴런의 이미징에는 더 높은 배율이 필요할 수 있습니다.

그림 1: 면역형광 이미징을 준비하기 위한 뇌 장착. (A) 뇌는 뇌가 평평해지는 것을 방지하기 위해 브리지 커버가 있는 SuperFrost Plus 슬라이드에 장착됩니다. 두 개의 "베이스" 커버 슬립을 투명한 손톱 광택제가 있는 Superfrost Plus 양전하 슬라이드에 부착한 다음 해부된 뇌를 그 사이의 슬라이드에 놓습니다. 투명한 "브리지" 커버 슬립을 뇌 위에 놓고 베이스 커버 슬립에 부착합니다. (B) 손톱 광택제가 마르면 Vectashield를 다리 아래에 천천히 피펫으로 넣어 2차 항체의 형광을 보존합니다. 그런 다음 투명 손톱 광택제를 사용하여 "브리지" 커버 슬립의 상단과 하단을 밀봉합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.