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이 프로토콜은 Zhang et al, The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌한 것입니다.
C. elegans 장의 항체 염색
- 고정
- 깨끗한 유리 슬라이드를 가지고 폴리-L-라이신을 사용하여 벌레가 붙을 수 있는 박막을 생성합니다. 슬라이드에 30μL 0.1-0.2% 폴리-L-라이신을 놓고 폴리-L-라이신 드롭에 두 번째 슬라이드를 놓아 "샌드위치"를 만듭니다. 그런 다음 슬라이드를 몇 번 부드럽게 문질러 양쪽 표면 전체를 적시고 30분 동안 자연 건조시킵니다. 슬라이드의 젖빛 면에 연필로 레이블을 지정합니다.
참고 : 200 μL의 0.2 % 폴리 -L- 라이신 분취량은 분말을 dH2O에 용해시켜 만들었습니다. 이것은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 벌레의 접착력을 향상시키기 위해 고분자량 폴리-L-라이신을 사용하십시오. 폴리-L-라이신의 농도도 중요합니다. 농도가 너무 낮으면 벌레가 달라붙지 않지만 농도가 너무 높으면 형광 배경 신호가 생성될 수 있습니다. 너무 두꺼운 필름은 전체가 헐거워질 수 있습니다.
- 액체 질소로 채워진 용기(예: 폴리스티렌 용기)의 바닥에 평평한 금속 블록을 단단히 놓습니다.
참고: 대신 드라이아이스를 사용할 수 있지만 액체 질소는 용기 바닥의 금속 블록을 더 안정적으로 유지하고 잘 냉각됩니다.
- M9로 접시에서 지렁이를 씻어내거나 각 슬라이드에 다른 단계 지렁이(알, L1, L2, L3 또는 L4 애벌레 단계 지렁이)를 선택하여 지렁이를 수집합니다. 일반적으로 각 슬라이드에 ~100마리의 유충과 배아 또는 ~20마리의 성충을 선택합니다. 씻어낸 10 μL의 지렁이를 슬라이드 중앙에 놓거나 알/지렁이를 10 μL M9 또는 10 μL 1x PBS(인산염 완충 식염수)에 넣습니다.
- 피펫을 사용하여 많은 수의 벌레를 퍼뜨려 뭉치지 않도록 합니다.
참고: 밀집과 스테이지의 두께가 다르기 때문에 씻겨진 웜의 혼합 개체군은 잘 붙지 않고 덜 효과적으로 동결 균열되므로(아래 참조) 스테이지별 웜(또는 동기화된 개체군)을 선택하면 우수한 결과를 얻을 수 있습니다. 유충은 성인보다 더 잘 달라붙고 슬라이드당 더 많은 동물을 배치할 수 있습니다.
- 슬라이드에 있는 벌레를 고르기 전에 OP50 박테리아가 없는 선충 성장 배지(NGM) 플레이트로 옮깁니다. 기생충에 부착된 과도한 박테리아도 부착을 방해할 수 있습니다. 벌레가 마르지 않도록 주의하십시오.
- 수집된 웜 위에 22mm × 22mm 커버슬립을 가로로 부드럽게 놓아(떨어뜨림) 가장자리가 슬라이드의 적어도 한쪽 면에 걸리도록 합니다. 커버 슬립을 한 두 손가락으로 부드럽게, 그러나 단단히 누릅니다. 조직의 무결성을 손상시킬 수 있는 전단을 피하십시오.
- 즉시 슬라이드를 액체 질소의 금속 블록으로 부드럽게 옮기고 약 5분 동안 그대로 두어 얼립니다. 그런 다음 돌출된 가장자리를 사용하여 한 번의 빠른 움직임으로 커버슬립을 "튕겨냅니다".
참고: 이 단계는 단호하게 수행되어야 하며 큐티클의 "균열"을 달성하기 위해 슬라이드가 얼어붙은 상태에서 수행해야 합니다. 주의: 액체 질소로 작업할 때는 PPE(개인 보호 장비) 지침을 따르십시오.
- 동결 균열된 슬라이드를 메탄올로 채워진 유리 Coplin 용기에 -20°C에서 5분 동안 담그십시오. 그런 다음 아세톤으로 채워진 유리 코플린 병에 -20 ° C에서 5 분 더 옮깁니다 .
참고: 메탄올과 아세톤은 사용하기 전에 최소 30분 동안 -20°C에서 보관해야 합니다. 고정 후 슬라이드는 -20 °C에서 보관할 수 있습니다 .
주의: 메탄올과 아세톤은 독성이 있습니다.
- 병에서 슬라이드를 제거하고 사용하기 전에 실온(RT)에서 자연 건조하십시오.