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이 프로토콜은 Tauc et al., Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging, J. Vis. Exp. (2014)에서 발췌한 것입니다.
참고: 이 프로토콜이 FAC 정렬로 ISC를 격리하는 데 처음 사용되는 경우 FACS 매개변수를 초기에 올바르게 설정하기 위해 다음 제어가 필수입니다. 야생형에서 해리된 세포(예: w1118) Sytox가 없는 초파리 중창자. 야생형(예: w1118) Sytox를 사용한 초파리 중장에서 해리된 세포(3.6단계 참조). Sytox가 없는 esg-Gal4, UAS-GFP 플라이 라인의 중장에서 해리된 세포.
1. 장 해부를 위한 용액 및 요리 준비
- esg-Gal4, UAS-GFP 플라이 라인에서 40마리의 암컷 파리를 각각 포함하는 4-6개의 바이알을 준비합니다.
- 10x PBS 원액에서 500ml 1x PBS(1.8mMNaH2, PO,4·H2O, 8.4mM, Na2HPO,4·2H2O, 175mM NaCl, pH를 7.4로 조정)를 준비합니다.
- 1x PBS에 3.5% 아가로스 용액을 준비합니다(100ml 1x PBS에 3.5g 전기영동 등급 아가로스). 이 용액을 페트리 접시(직경 8.5cm)에 부어 바닥을 덮어 해부 플레이트를 준비합니다. 아가로스 층은 박리 절차 중에 겸자 끝이 손상되는 것을 방지합니다. 겔이 응고된 후 해부 플레이트를 4°C에서 보관하십시오.
- 해부하기 전에 1x PBS + 1% BSA 300ml를 신선하게 준비하고 병을 얼음 위 또는 4°C에 놓습니다.
- 원심분리기를 켜고 4°C로 식힙니다.
- 2개의 유리 파스퇴르 피펫의 끝 부분에 불을 붙여 가장자리를 매끄럽게 만듭니다.
- 집게 두 쌍과 면도날 한 개를 70% 에탄올로 청소합니다.
- 얼음 위에서 절개된 중창자를 채취하기 위해 4-6개의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 놓습니다.
2. 위장관의 준비 및 중장 해부
- 표준 플라이 베드에서 CO2가 포함된 하나의 바이알(40마리)에서 파리를 마취하고 면도날을 사용하여 모든 파리의 목을 베고 해부 접시로 옮깁니다. 차가운 1x PBS/1% BSA 용액을 해부 접시에 붓고 아가로스 겔을 덮습니다. 파리가 떠다닐 것입니다.
- 한 쌍의 집게로 파리의 복부를 잡고 다른 한 쌍의 집게로 흉부를 잡습니다. 흉부와 복부를 분리하십시오. 장이 보이고 앞장/작물은 여전히 흉부와 연결되어 있을 가능성이 큽니다.
- 내장을 잡고 흉부에서 빼냅니다. 장을 펴려면 작물을 잡고 장을 복부에서 약간 앞쪽으로 당깁니다.
- 한 쌍의 집게로 복부의 뒤쪽 끝을 잡고 다른 한 쌍의 집게로 앞쪽으로 열린 큐티클의 가장자리를 잡습니다. 튀어나온 장 조직이 파괴되지 않도록 주의하세요. 뒤쪽 끝을 당겨 큐티클을 끊고 장 전체가 복강에서 빠져나올 때까지 뒤쪽을 매우 부드럽게 계속 당깁니다. 작물이 너무 커서 체강을 통과할 수 없는 경우 미리 제거해야 할 수도 있습니다.
- 앞장, 말피기안세뇨관, 뒷장 및 난소를 제거하여 맨 중장을 떠납니다.
- 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 절개된 중장 배치를 차가운 1x PBS/1% BSA 용액이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 유지합니다. 샘플은 2시간 이내에 처리해야 합니다.
- 전체 배치의 해부가 완료된 후 해부 접시를 이중 증류수로 헹구어 남은 파편을 씻어냅니다. 다음 중장 배치를 해부하기 시작합니다(2.1–2.7단계 반복). 2시간 이내에 가능한 한 많은 배치를 해부한 다음 3.1단계로 진행합니다.
3. FAC 분류를 위해 세포를 수확하기 위한 소화관 조직
- 중장에서 1x PBS/1% BSA 용액을 제거하고 각 샘플에 0.5% 트립신-EDTA 용액 500μl를 추가합니다.
- 20초 동안 잘 소용돌이치고 실온에서 25-30분 동안 20rpm으로 부드럽게 흔들거나 회전하여 샘플을 배양합니다.
- 약 30분 후에 다시 소용돌이를 일으키고 손상되지 않은 중장 조직이 튜브 바닥으로 가라앉도록 합니다. 화염 유리 파스퇴르 피펫으로 현탁액에 있는 세포를 조심스럽게 제거하고 35μm 나일론 메쉬를 통해 새 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 여과합니다.
- 100 x g에서 4°C에서 5분 동안 셀을 스핀다운합니다. 참고로, 분해를 시작할 때 세포 펠릿은 처음에는 보이지 않을 수 있지만 조직 분해가 진행됨에 따라 보이게 됩니다.
- 트립신 용액을 손상되지 않은 중장 조직이 들어 있는 원래의 샘플 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 펠릿에서 너무 많은 세포를 옮기지 마십시오.
- 400μl의 차가운 1x PBS/1% BSA에 세포 펠릿을 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 해리된 세포가 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 얼음 위에 보관하고 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 세포를 빛으로부터 보호하십시오.
- 남아있는 손상되지 않은 중장 조직을 포함하는 트립신 용액을 다시 소용돌이치고 샘플을 실온에서 30분 동안 로커에 놓습니다.
- 모든 중장 조직이 소화될 때까지 3.3-3.4.3단계를 반복합니다. 모든 마이크로 원심분리기 튜브에서 해리된 세포를 하나의 마이크로 원심분리기 튜브로 결합합니다. 이를 위해서는 3.4에서와 같은 원심분리 단계가 필요할 수 있는데, 이는 결합된 모든 세포 현탁액의 부피가 1.5ml를 초과할 수 있기 때문입니다. 세포 현탁액을 얼음 위에 유지하고 빛으로부터 세포를 보호하십시오.
- 해리된 세포를 100 x g에서 4°C에서 5분 동안 스핀다운합니다. 가능한 한 많은 상층액을 조심스럽게 제거하여 마이크로 원심분리기 튜브에 약 50-100 μl의 1x PBS/1% BSA 용액을 남겨둡니다. Sytox(1:20,000)를 포함하는 800μl 1x PBS/1% BSA에서 해리된 세포를 부드럽게 재현탁합니다.
- 셀 스트레이너 스냅 캡(35μm 나일론 메쉬)을 통해 셀을 필터링하여 세포 현탁액을 5ml 둥근 바닥 Falcon 튜브로 옮깁니다. 항상 세포 샘플을 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오. 이제 셀을 정렬할 준비가 되었습니다.
- RNAlater 용액 600μl를 각 마이크로 원심분리기 튜브에 피펫으로 주입하여 후속 RNA 분리를 위해 세포를 분류합니다. 다른 다운스트림 응용 분야의 경우 세포를 다른 용액(예: 멸균 PBS)에서 수집할 수 있습니다.