수명 분석: 예쁜꼬마선충(C. elegans) 수명 측정

Abstract

출처: Cornwell, A. B., et al. 레플리카 세트 방법: 예쁜꼬마선충의 수명을 정량적으로 측정하는 고처리량 접근 방식. J. Vis. 특급.(2018).

이 비디오는 예쁜꼬마선충의 수명을 측정하는 전통적인 플레이트 기반 방법을 설명합니다. 예시 프로토콜은 RNAi로 처리된 기생충의 수명을 측정합니다.

Protocol

다음 프로토콜은 Cornwell et al, The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp. (2018).

1. 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)의 첨가에 의한 자손 생산 방지

1. 20°C에서 L4 단계까지 동물을 성장시킵니다. 시딩 후 약 40시간 후에 동기화된 동물이 L4로 발달했는지 확인합니다(단계 2.1.7).
   참고: 예쁜꼬마선충의 발달 시간은 온도에 따라 다르며, 속도가 특성화되지 않은 돌연변이 동물의 성장률은 경험적으로 테스트되어야 합니다.
   1. L4 동물이 있는 각 6cm 플레이트에 160μL의 50x FUdR을 추가합니다.
      참고: L4 단계에서 FUdR을 추가하는 것이 중요합니다. 편의상 FUdR 1g을 10mL 초순수 H₂O에 용해시켜 FUdR을 1,000배 추출합니다. 0.2μm 필터와 10cc 주사기로 스톡 FUdR을 필터 살균합니다. ~1mL의 스톡을 멸균 1.5mL 튜브에 부분 표본으로 추출합니다. 얼려서 -20 °C에서 보관하십시오.
2. 수컷 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 존재 여부가 있는지 플레이트를 검사합니다.모든 수컷을 제거합니다.
   참고: 수명은 일반적으로 수컷이 아닌 자웅동체에 대해 측정됩니다. 짝짓기를 하는 자웅동체는 FUdR이 있는 경우에도 짝짓기를 하지 않은 동물보다 수명이 짧습니다. 수컷은 자웅동체보다 작고 가늘며 독특한 갈고리 꼬리로 쉽게 식별할 수 있습니다.
3. 상자를 지퍼백에 다시 넣습니다. 20°C 인큐베이터로 돌아갑니다.

2. 득점 가능성

1. 백금 와이어나 속눈썹으로 동물의 머리를 부드럽게 만져 매일 생존 능력을 높이십시오. 움직이지 않는 동물을 죽은 것으로 간주하고 접시에서 제거합니다(그림 1A). 모든 관측 시점에 대해 각 조건에 대해 관측된 데저(dead) 수를 기록합니다.
   참고: 채점 편향의 위험을 줄이기 위해 실험자는 실험 조건에 대해 맹인 상태를 유지해야 하며 마찬가지로 채점 중에 이전 시점의 결과를 참조해서는 안 됩니다.
2. 파열되거나, 다른 명백한 발달 결함으로 죽거나, 접시 옆으로 기어 올라가는 동물을 검열합니다: 이러한 동물을 제거하고 통계 분석에서 고려하기 위해 관찰된 각 시점의 숫자를 기록합니다. 또한 수컷이 발견되면 제거하고 관찰된 수를 기록하십시오.
3. 동물이 살아 있지 않을 때까지 매일 2.1단계부터 반복합니다.
   참고: 대장균의 잔디밭이 현저히 줄어들거나 곰팡이가 접시에서 자라기 시작하면 남아 있는 모든 동물을 적절한 RNAi 및 FUdR이 있는 새 접시로 옮깁니다.

Results

그림 1: 예쁜꼬마선충의 수명(A)을 점수화하기 위한 전통적 및 복제 세트 방법.예쁜꼬마선충의 수명을 점수화하는 전통적 방법. 조건별 동종 동물의 여러 소규모 동기화 개체군을 시간이 지남에 따라 추적합니다. 연구 과정 전반에 걸쳐 동일한 동물 개체군을 따릅니다. 생존 가능성은 움직임에 의해 평가되며, 이는 부드러운 찌르기에 의해 자극될 수 있습니다. 움직이지 않는 동물은 죽은 것으로 점수가 매겨지고 생존 가능한 동물이 남지 않을 때까지 제거됩니다(흡인 표시). (B). C. elegans 수명을 점수화하기 위한 복제 세트 방법. 연령 동기화된 동종 동물의 많은 개체군이 여러 개의 동일한 복...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FuDR(5-플루오로-2'-데옥시우리딘)	알파 에자르	L16497
24 우물 문화 플레이트	Greiner 바이오 원	#662102
600 μL 96웰 플레이트	Greiner 바이오 원	#786261
2mL 96웰 플레이트	Greiner 바이오 원	#780286
96핀 플레이트 리플리케이터	눕크	제250520
C. HT115 박테리아의 예쁜꼬마선충 RNAi 클론 라이브러리- Ahringer	출처: Bioscience	C. elegans RNAi 수집 (Ahringer)	Kamath et al, Nature 2003 참조.
C. 예쁜꼬마선충 RNAi 클론 라이브러리 HT115 박테리아 - Vidal	출처: Bioscience	C. elegans ORF-RNAi 자원(Vidal)	Rual et al, Genome Research 2004 참조. 이 라이브러리는 Dharmacon에서도 사용할 수 있습니다.
L4440 빈 벡터 플라스미드	애드진	1654	https://www.addgene.org/1654/