효소 분해 및 수동 해리: 세포 배양을 위해 예쁜꼬마선충 배아를 준비하는 방법

초록

출처: Sangaletti, R. and Bianchi, L. 배아 예쁜꼬마선충 세포 배양 방법.J. Vis. 특급(2013).

이 동영상은 in vitro에서 배아 예쁜꼬마선충 세포를 분리하고 불임 배양하는 방법을 소개합니다.

프로토콜

1. 배아 세포 해리

1. 층류 후드를 사용하여 멸균 상태에서 절차의 다음 단계를 수행합니다. 동물들이 박테리아 플레이트에 가운을 입는 동안, 표백제가 함유된 용해 용액으로 세척하고 처리하면 모든 박테리아는 아니더라도 대부분의 박테리아를 제거해야 합니다. 따라서 절차의 이 시점에서 층류 후드를 사용하면 난자 현탁액의 새로운 오염을 방지할 수 있습니다.
2. 펠릿화된 난자를 2mg/ml 키티나제 1ml(난자 완충액 pH 6.5에 저장)에 재현탁하고 새로운 멸균 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 실온에서 10-30분 동안 튜브를 흔듭니다. 정확한 배양 시간은 효소의 신선도와 실내의 온도에 따라 달라지므로 각 준비에 대해 결정해야 합니다. 배양 10분 후 거꾸로 된 세포 배양 현미경으로 난자를 모니터링하기 시작하는 것이 좋습니다. 참고: 우리의 경험에 따르면 pH가 낮으면 키티나제 효소 활성이 증가합니다. 이러한 이유로 당사는 pH 6.5의 난자 완충액을 사용하여 키티나아제를 용해시킵니다(위에 보고된 레시피, 여기서 pH는 NaOH를 사용하여 6.5로 조정됩니다).
3. 키티나제 처리로 난자의 ~ 80%가 소화되면(그림 1 A-B), 900 x g(~2,500rpm)에서 3분 동안 원심분리하여 난자를 펠렛화합니다.P1000 피펫터와 멸균 팁을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 L-15 배지 3ml를 추가합니다.
4. 난자를 직경 6cm의 플레이트에 옮기고 18g 바늘이 장착된 10ml 멸균 주사기를 사용하여 세포를 부드럽게 분리합니다. 새로운 플라스틱 페트리 접시에 현탁액 한 방울을 떨어뜨리고 현미경으로 관찰하여 해리 정도를 모니터링합니다. 세포 손상을 방지하기 위해 이 절차를 수행하는 동안 주사기로 공기를 흡입하지 마십시오. 세포의 ~ 80 %가 해리 될 때까지 해리를 계속하십시오.
5. 멸균 5μm Millipore 필터를 사용하여 현탁액을 여과합니다. 세포 덩어리, 소화되지 않은 알 및 부화한 유충을 제거하기 위해 세포 현탁액을 여과해야 합니다. 필터를 통해 추가 4-5ml의 새로운 L-15 매체를 필터링하여 모든 세포를 복구합니다. 필터 및/또는 셀의 손상을 방지하기 위해 여과 단계에서 과도한 힘을 가하지 마십시오.

2. 세포 배양

1. 900 x g(~2,500 rpm)에서 3분 동안 원심분리하여 해리된 세포를 펠렛화합니다.P1000 피펫터와 멸균 팁을 사용하여 모든 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 펠릿화된 세포를 완전한 L-15 배지에 재현탁시키고 1ml/웰을 플레이트화합니다. 추가되는 매체의 양은 8P의 수에 따라 다릅니다 사용 된 플레이트, 플레이트에있는 웜의 합류 및 세포에서 수행 될 실험 유형. 세포 밀도는 혈구계를 사용하여 측정할 수 있습니다. 패치 클램프 기록의 경우 ~ 230,000 cells/^cm2의 도금 밀도가 최적입니다.
2. 배양 매체의 증발을 방지하기 위해 젖은 종이 타월이 들어 있는 플라스틱 타파웨어 용기에 24웰 플레이트를 보관하십시오. 용기를 20°C와 주변 공기의 가습 인큐베이터에 보관하십시오.
3. 세포는 일반적으로 GFP 마커의 형태학적 분화 및 발현이 완료될 때 24시간 이내에 실험할 준비가 되어 있습니다. 세포는 최대 2주 동안 배양할 수 있지만 일반적으로 도금 후 7-9일까지 가장 건강합니다. 건강한 세포를 유지하기 위해 배지를 하루에 한 번 교체해야 합니다.

결과

그림 1. 키티나아제 처리 전과 후의 예쁜꼬마선충 배아. (A) 키티나아제에 노출되기 전의 난자 사진. 화살표는 배아를 둘러싸고 있는 투명하고 손상되지 않은 난자를 가리킵니다. (B) 10분 동안 키티나제로 처리된 난자. 난각은 소화되어 더 이상 배아 주변에서 볼 수 없습니다. 화살표는 난자 껍질에서 방출된 세 겹의 배아를 가리킵니다. 파란색 상자는 여전히 서로 연결되어 있는 셀 그룹을 둘러쌉니다.

재료

<표 테두리="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="738"> 이 논문에 사용된 재료 목록 이름 회사 카탈로그 번호 댓글 시약 Leibovitz의 L-15 미디엄(1x) 리퀴드 인비트로젠 제11415-064호 태아 소 세럼 인비트로젠 제16140-063호 페니실린 - 스트렙토 마이신 시그마 P4333-100ML Streptomyces Griseus의 키티나아제 시그마 C6137-25유엔 땅콩 렉틴 시그마 L0881-10MG 장비 101-1000 μl 블루 눈금 피펫 팁 미국 Scentific 제1111-2821호 10ml 멸균 피펫 개별 포장 미국 Scentific 제1071-0810호 Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) 팁 이젝터가 있는 피펫터 VWR 인터내셔널 Inc. 89079-974 휴대용 피펫 에이드, 드러먼드 VWR 인터내셔널 Inc. 53498-103 플라스틱 피펫 멸균 전송 VWR 인터내셔널 Inc. 제14670-114호 15ml 원뿔형 튜브 미국 Scentific 1475-1611년 멸균 18 게이지 바늘 Becton, Dickinson and Co. (벡턴, 디킨슨 앤 컴퍼니) 305196 멸균 10ml 주사기 Becton, Dickinson and Co. (벡턴, 디킨슨 앤 컴퍼니) 305482 플라스틱 주사기 필터 코닝 0,20 μm 기공 크기 코 닝 431224 Acrodic 25mm 주사기 필터 w / 5 μm versapor 멤브레인 VWR 인터내셔널 Inc. 제28144-095호 60x15 mm 페트리 접시 멸균 VWR 인터내셔널 Inc. 82050-548년 100x15mm 페트리 접시 멸균 VWR 인터내셔널 Inc. 82050-912년 12mm 직경의 유리 커버 슬립 VWR 인터내셔널 Inc. 제48300-560호 Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid 토마스 사이언티픽 6902A09 (영문) Dumont #5- 파인 펜치 정밀 과학 도구 11254-20년 원심분리기 5702 에펜도르프 22629883 층류 후드 x10 대물렌즈가 있는 도립 현미경 주변 공기 가습 인큐베이터